近平滑假丝酵母立体选择性还原酶表达、结构解析与改造

摘要

氧化还原酶是一种具有高度立体选择性的生物催化剂，常用于生物转化光学活性的手性化合物。在众多的微生物氧化还原酶源中，来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(R)-和(S)-羰基还原酶催化2-羟基苯乙酮产生不同立体化学性质的苯基乙二醇，其中(R)-羰基还原酶催化2-羟基苯乙酮到(R)-苯基乙二醇的可逆反应，而(S)-羰基还原酶催化2-羟基苯乙酮的还原反应，产生(S)-苯基乙二醇。为了更好地提高上述两种生物催化剂手性转化的适用性能，本研究通过改良(R)-羰基还原酶的编码基因，优化了目标蛋白的表达量：同时用X-衍射和分子置换的方法解析了(S(-羰基还原酶的蛋白空间结构，基于精细的三维结构及催化功能域的研究，利用蛋白质工程技术，理性设计了辅酶特异性和界面特性变化等一系列功能突变体，为酶催化功能的认识和改造提供了新的研究视点。
　　 依据大肠杆菌(Escherichia coli)对密码子的偏好性，用细胞偏爱的密码子同源置换出(R)-羰基还原酶编码基因中的9个稀有密码子，同时切除5’末端的无序结构序列4-27 bp。研究结果表明密码子的优化较好地提高丁蛋白表达量，酶活力比优化前提高了35.7%。原子力显微镜观察结果表明高浓度的酶单体分子多聚为网状结构，但是当加入少量的辅酶(NAD+，NADH)或底物时，蛋白由网状结构转为椭圆形低聚态，与低浓度酶形成的聚合态相同。动力学研究表明酶催化2-羟基苯乙酮的KM和kcat分别是催化(R)-苯摹乙二醇的0.5和1.8倍，即它们的kcat/KM比值约等于4.0。同时酶与辅酶NAD+的结合常数Kd是酶与NADH的近3倍。说明酶更易催化NADH链接的2-羟基苯乙酮的还原反应，较难催化NAD+链接的(R)-苯基乙二醇的氧化反应。
　　 采用SOE-PCR法克隆出增强型荧光蛋白标记的(R)-和(S)-羰基还原酶蛋白融合基因，构建到真核pYX212表达载体中，以荧光蛋白为筛选标志，发现两种羰基还原酶在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)细胞中多定位于细胞膜(如高尔基体等内膜系等)，少数成点状分布于胞内。根据荧光强度分析可知(S)-羰基还原酶的表达水平明显高于(R)-羰基还原酶。荧光蛋白融合型(R)-羰基还原酶催化2-羟基苯乙酮获得产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为86.6%和70.4%。荧光蛋白融合型(S)-羰基还原酶催化2-羟基苯乙酮生成产物(S)-型对映体的光学纯度和产率分别92.3%和81.8%。说明两种羰基还原酶与荧光蛋白的融合不影响酶蛋白的正确折叠和生理催化功能。
　　 利用分子重组技术，将6×Histidine的标签分别与(R)-和(S)-羰基还原酶进行融合，克隆其融合基因，置于AOX1的甲醇诱导型启动子下游，构建重组毕赤氏酵母菌株GS115，实现了两种羰基还原酶的高效异源表达。经培养条件的优化，它们的最佳表达条件基本相同：pH7.0，OD600为2.0-2.5，甲醇的日诱导添加量为1%，甲醇诱导后菌体培养的时间为3.5-4天。在优化表达条件下，(R)-和(S)-羰基还原酶外泌蛋白的表达量分别为185 mg/L和270 mg/L，酶比活分别为1.35 U/mg和3.41U/mg。Western杂交结果显示6×Histidine标签已特异性地结合于两种酶蛋白上，经过Ni2+柱一步法亲和层析后的靶蛋白纯度均高于90%。生物转化实验表明纯化后的(R)-和(S)-羰基还原酶的最适反应的pH分别为8.0-9.0和7.0，其中(R)-羰基还原酶催化产生(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为89.5%和78.4%。(S)-羰基还原酶催化合成产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别为96.9%和88.7%。低浓度(5 mmol/L)的Zn2+对(R)-羰基还原酶催化2-羟基苯乙酮的还原反应具有明显的促进作用，当反应体系中添加5 mM Zn2+时，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别可以达到94.3%和86.5%。
　　 将近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)的(R)-和(S)-羰基还原酶基因构建到含双克隆位点的表达载体pETDuetTM-1中，构建重组质粒pETDuet-RCR-SCR。同时将大肠杆菌(E.coli)的嘧啶核苷酸转氢酶A和B亚基基因克隆到表达载体pACYCDuet-1上，构建重组质粒pCACYD-PNTA-PNTB。将两种重组质粒分别转化或共转化表达宿主E.coli BL21(DE3)，构建同时带有两个或四个目的基因的重组菌株。生物转化实验表明共转化重组菌具有高效生物催化(R)-苯基乙二醇，一步法转化(S)-苯基乙二醇的功能，其产物光学纯度为96.3%e.e.，产率为91.9%，与只含有(R)-和(S)-羰基还原酶基因共表达体系相比较，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别提高了32%和39.2%。
　　 采用悬滴泫对纯化的重组(S)-羰基还原酶进行结晶条件筛选及条件优化，获知该蛋白晶体的最佳生长条件为：18%(w/v) polyethylene glycol2000 monomethylether(PEG2K MME)和8%(v/v)异丙醇。X-衍射最好的晶体大约在5天后获得，其大小为0.4×0.3×0.3 mm。以Agaricus bisporus甘露醇脱氢酶(MtDH，1H5Q)为同源模型，采用分子置换法解析(S)-羰基还原酶的结构，其空间群属于P212121，晶胞参数为：a=104.7 A，b=142.8 A和c=151.8 A。其最终结构模型的分辨率修正到2.69-A，Rfree和Rwork分别26.4%和20.5%，具有很好的立体化学特性。一个不对称单位中有八个单体分子，组成两个四聚体，或者说一个不对称单位有四个二聚体，每个二聚体关于所谓的Q轴对称。从已解析出来的结构发现该酶与典型短链脱氢酶不同，主要表现在三个方面：(1)N端有一个约含30个氨基酸的肽段尾巴，起着平衡Q轴的作用；(2)二元对称轴不规范，有大约15°的偏角。因而形成非标准的2-2-2对称的四聚体；(3)在四聚体中，四个之中的二个NADPH可能的结合区域被周围的肽段所占据。分子筛排阻实验结果表明辅酶NADPH与(S)-羰基还原酶的结合能够诱导一个无活性的四聚体向有活性四聚体的转化。
　　 采用定点突变的方法，构建了包括N末端的肽段，保守的催化三元区域以及位于界面与界面之间的关键氨基酸位点的突变。实验结果表明(S)-羰基还原酶的N-末端肽段在很大程度上起着平衡四聚体的Q轴作用，对酶活几乎没有贡献。与其它短链脱氢酶一样，(S)-羰基还原酶也使用相同的保守催化二元区域Ser-Tyr-Lys。定点突变的研究结果表明保守的Ser-Tyr-Lys催化三元区域对催化功能是必需的。在(S)-羰基还原酶二元对称轴的疏水界面上，βG折叠中的一个紧密折叠的缬氨酸被一个带负电的氨基酸天冬氨酸即V270D，打破了原始的四聚态。超速分析的结果证实突变体V270D在溶液中表现为同源二聚体，动力学研究表明二聚体酶仍旧保持原始的催化功能。圆二色谱温度扫描结果显示所有突变体蛋白的稳定性均低于野生型酶，它们的熔化温度比野生型酶低4.7℃。
　　 为迎合工业应用需求，使(S)-羰基还原酶的辅酶依赖性由昂贵的NADPH转变为较便宜的NADH将产生非常重要的意义。因而根据(S)-羰基还原酶蛋白结构，理性设计了位于辅酶结合口袋或其附近的βB和αC之间所谓磷酸结合区域中关键氨基酸的定点突变，包括Ser67Asp. His68Asp和Pr069Asp点突变的不同组合。生物转化实验研究表明所有的突变体均催化2-羟基苯乙酮产生(R)-苯基乙二醇，但产物的光学活性和产率各不相同。其中在辅酶NADH链接反应中，突变体酶S67D/H68D催化产生(R)-对映体，其光学活性和产率分别为95.4%和83.1%。与野生型酶相比较，当NADH和NADPH作辅酶时，突变体S67D/H68D的kca/KM值分别增加10倍和降低20倍，而kcat值保持小变。NADPH链接反应中，突变体S67D/H68D和野生型酶的Kd值分别是NADH链接反应中的0.28和1.9倍，表明突变体S67D/H68D酶具有更强NADPH的亲和性和更低的NADH依赖性。圆二色谱分析结果表明突变体S67D/H68D与野生型表现出相似的蛋白二级结构和熔化温度。温度变性和尿素变性实验结果表明NAD(H)对突变体S67D/H68D具有很好的保护作用，而以此相对应的是NADP(H)对野生型酶具有很好的保护作用。由此可见双位点S67D/H68D的突变在没有改变酶的稳定性的基础上，不仅成功改变了辅酶的特异性，而且改变了产物的空间选择性。该研究为采用蛋白质工程技术改变短链脱氢酶的辅酶特异性和产物的空间选择性提供了一个崭新的例证，同时也为手性醇的工业制备提供了有价值的研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪 论

1.1 立体选择性氧化还原酶的研究概况

1.2 立体选择性氧化还原酶催化体系

1.2.1 氧化还原酶体系的认识

1.2.2 氧化还原酶的基因克隆及表达

1.2.3 氧化还原酶基因的优化表达

1.2.4 氧化还原酶的纯化、酶学性质及亚细胞定位

1.2.5 氧化还原酶的辅酶选择性及辅酶再生

1.3 脱氢酶(还原酶)的结构与功能

1.3.1 脱氢酶的分类

1.3.2 短链脱氢酶序列分析比较

1.3.3 短链脱氢酶的业类

1.3.4 短链脱氢酶的单体结构

1.3.5 短链脱氢酶的催化功能和理性改造

1.4 蛋白质晶体学的研究进展

1.4.1 蛋白质结构解析的主要步骤

1.4.2 蛋白质结晶

1.4.3 相位的确定

1.4.4 结构修正

1.4.5 模型质量分析结构修正

1.5 本课题研究内容

1.5.1 本研究所用立体选择性氧化还原酶的背景

1.5.2 本课题研究目的和意义

1.5.3 本课题研究思路与内容

1.5.4 论文各部分的主要内容

第二章 (R)-羰基还原酶的密码子优化表达和理化性质研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌种和质粒

2.2.2 培养基

2.2.3 主要试剂

2.2.4 主要仪器

2.2.5 (R)-羰基还原酶密码子优化基因的克隆

2.2.6 (R)-羰基还原酶的诱导表达

2.2.7 酶的纯化

2.2.8 目的蛋白的质谱分析

2.2.9 酶活力测定

2.2.10 重组菌细胞催化不对称转化

2.2.11 原子力显微镜(AFM)观察蛋白形态

2.2.12 超速离心分析

2.2.13 圆二色谱(CD)分析

2.2.14 荧光色谱分析

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章(R)-和(S)-羰基还原酶在酿酒酵母中的功能表达和亚细胞定位

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 培养基

3.2.3 主要试剂

3.2.4 主要仪器

3.2.5 重组酿酒酵母的构建

3.2.6 重组蛋白的SDS-PAGE分析

3.2.7 酿酒酵母重组蛋白的纯化

3.2.8 激光共聚焦显微镜观察

3.2.9 酶活力及蛋白含量的测定

3.2.10 重组菌细胞催化不对称转化

3.3 结果

3.3.1 重组质粒的构建

3.3.2 融合基因与pYX212载体的连接

3.3.3 两种羰基还原酶在酿酒酵母中的表达

3.3.4 两种酿酒酵母重组型羰基还原酶的纯化

3.3.5 重组细胞高效催化不对称转化反应

3.3.6 两种羰基还原酶的亚细胞定位

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 (R)-和(S)-羰基还原酶在毕赤氏酵母中的高效表达及一步法纯化策略

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌种与质粒

4.2.2 培养基

4.2.3 主要试剂

4.2.4 主要仪器

4.2.5 重组毕赤氏酵母的构建

4.2.6 重组毕赤氏酵母的优化表达

4.2.7 重组蛋白的SDS-PAGE分析

4.2.8 毕赤氏酵母重组蛋白的纯化

4.2.9 酶活力及蛋白含量的测定

4.2.10 Western杂交

4.3 结果

4.3.1 重组质粒pPIC9K-his6-rcr的构建

4.3.2 毕赤氏酵母阳性克隆的选择

4.3.3 6×Histidine融合蛋白在毕赤氏酵母中的优化表达

4.3.4 从培养液中高效分离纯化出重组目标蛋白

4.3.5 以2-羟基苯乙酮为底物的酶活性的确定

4.3.6 不同的pH值对酶催化2-羟基苯乙酮还原反应的影响

4.3.7 少量的ZnCl2较好地促进(R)-羰基还原酶的转化效率

4.4 讨论

4.5 小结

第五章(R)、(S)-羰基还原酶和嘧啶核苷酸转氢酶偶联一步法催化(S)-苯基乙二醇

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌种与质粒

5.2.2 培养基

5.2.3 主要试剂

5.2.4 主要仪器

5.2.4 菌体培养及其基因组DNA的提取

5.2.5 (R)-和(S)-羰基还原酶基因的克隆

5.2.6 嘧啶核苷酸转氢酶A亚基(PNTA)和B亚基(PNTB)基因序列的扩增

5.2.7 重组质粒转化大肠杆菌

5.2.8 重组菌细胞催化不对称转化

5.3 结果

5.3.1 四个目的基因的克隆

5.3.2 表达质粒的构建

5.3.3 四种目标酶的表达

5.3.4 重组细胞催化不对称转化

5.4 讨论

5.5 小结

附图

第六章(S)-羰基还原酶的晶体生长与结构解析

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 菌种

6.2.2 培养基

6.2.3 主要试剂

6.2.4 主要仪器

6.2.5 (S)-羰基还原酶基因的克隆

6.2.6 (S)-羰基还原酶的诱导表达分析

6.2.7 酶的纯化

6.2.8 酶活力测定

6.2.9 重组菌细胞催化不对称转化

6.2.10 蛋白样品的预处理

6.2.11 蛋白结晶条件的筛选和优化

6.2.12 衍射数据的收集和处理

6.2.13 晶体结构的解析和修正

6.3 结果

6.3.1 (S)-羰基还原酶蛋白的表达与纯化

6.3.2 重组(S)-羰基还原酶的结晶筛选与优化

6.3.3 衍射数据的收集与处理

6.3.4 分子置换法解析(S)-羰基还原酶的母体晶体结构

6.3.5 (S)-羰基还原酶的母体晶体结构分析

6.4 讨论

6.5 小结

第七章(S)-羰基还原酶结构中关键氨基酸位点的功能研究

7.1 前言

7.2 材料与方法

7.2.1 菌种

7.2.2 培养基

7.2.3 主要试剂

7.2.4 主要仪器

7.2.5 (S)-羰基还原酶突变体基因的克隆

7.2.6 (S)-羰基还原酶突变体蛋白的诱导表达分析

7.2.7 酶的纯化

7.2.8 酶活力测定

7.2.9 重组菌细胞催化不对称转化

7.2.10 酶动力学研究

7.2.11 圆二色谱

7.2.12 超速分析

7.2.13 荧光退火分析

7.3 结果

7.3.1 (S)-羰基还原酶突变体蛋白表达与纯化

7.3.2 (S)-羰基还原酶突变体功能验证

7.3.3 保守的Ser-Tyr-Lys催化三元区域对催化是必需的

7.3.4 N末端的肽段起着平衡(S)-羰基还原酶低聚体的作用

7.3.5 四聚体对(S)-羰基还原酶酶活不是必需的

7.4 讨论

7.5 小结

第八章 定点突变改变(S)-羰基还原酶的辅酶特异性和酮还原的立体选择性研究

8.1 前言

8.2 材料与方法

8.2.1 菌种与质粒

8.2.2 培养基

8.2.3 主要试剂

8.2.4 主要仪器

8.2.5 (S)-羰基还原酶突变体基因的克隆

8.2.6 突变基因与表达载体pET21c的连接

8.2.7 (S)-羰基还原酶的诱导表达分析

8.2.8 酶的纯化

8.2.9 酶活力测定与动力学分析

8.2.10 蛋白含量的测定

8.2.11 酶催化不对称转化反应

8.2.12 超速离心分析

8.2.13 圆二色谱分析

8.2.14 温度和尿素变性分析

8.2.15 荧光色谱分析

8.3 结果

8.3.1 野生型和突变体蛋白的过量表达和纯化

8.3.2 定点突变改变酶催化酮还原产物的空间选择性

8.3.3 动力学特性表明S67D/H68D酶改变了辅酶的依赖性

8.3.4 双位点突变S67D/H68D不改变酶蛋白的折叠合及构象稳定性

8.3.5 不同的辅酶对野生型酶和突变体S67D/H68D具有不同的保护作用

8.4 讨论

8.5 小结

主要结论

论文创新点

致谢

参考文献

附录：作者在攻读博士学位期间发表(含待发表)论文及成果