近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）立体选择性氧化还原酶酶学性质的研究

摘要

立体选择性氧化还原酶是一种重要的生物催化剂，被广泛用于不对称合成医药、化工、农业、食品等不同领域的众多功能性手性化合物，因其独特的优越性，成为近年来国内外研究的热点。光学纯苯基乙二醇是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体。近平滑假丝酵母(CandidaparapsilosisCCTCC203011)，能将混旋的苯基乙二醇去消旋化生成S型苯基乙二醇，光学纯度(e.e值)大于99％，转化率为90％以上。为深入研究该转化过程中酶催化去消旋反应机制，进行相关立体选择性氧化还原酶的分离纯化及酶学性质的研究，具有重要的现实意义和理论价值。 从近平滑假丝酵母(CandidaparapsilosisCCTCC203011)中分离得到了NAD(H)依赖型的(R)-苯基乙二醇次级醇脱氢酶。粗酶经乙醇分级沉淀(30～60％)、BlueSepharoseFastFlow6亲和层析、DEAESepharose离子交换层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带，其酶蛋白的亚基分子量为37.5kD。催化氧化还原反应的最适温度为45℃，酶促氧化反应的最适pH为9.0，对底物酮催化还原的最适pH为6.0。同时研究发现该酶是一个含Zn2+金属酶；仅对次级醇和次位的羰基具有很高的氧化还原活力；此外，该酶具有立体选择性，在氧化苯基乙二醇时，只对(R)-苯基乙二醇的次位羟基发生氧化，生成α-羟基苯乙酮；又能不对称还原α-羟基苯乙酮的羰基，生成(R)-苯基乙二醇。经LC-MS-MS分析得到了酶蛋白中三个肽段的氨基酸序列，通过比对发现该酶与NCBI编号为BAA24528的次级醇脱氢酶具有较高的同源性。 从近平滑假丝酵母(CandidaparapsilosisCCTCC203011)中分离得到了新的NADPH依赖型羰基还原酶。粗酶经硫铵分级沉淀、DEAESepharoseFF离子交换层析、PhenylSepharoseFF疏水层析、BlueSepharose6FF亲和层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带，其酶蛋白为单亚基结构，相对分子量为30kD。该酶还原反应的最适pH为4.5，最适温度为35℃，Cu2+对羰基还原酶有强烈的抑制作用。该酶具有较高的底物专一性和立体选择性，对α-羟基苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯具有较高的不对称还原活力，其产物分别为(S)-苯基乙二醇和(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，e.e.值分别为99％和94.3％。因此该酶蛋白是不对称合成手性醇有效的生物催化剂之一。经LC-MS-MS分析得到了酶蛋白中一个肽段的氨基酸序列，通过比对发现该酶与假定蛋白(hypotheticalproteinCaO19.10414)具有一定的同源性。 在纯酶水平验证了近平滑假丝酵母(CandidaparapsilosisCCTCCM203011)对外消旋苯基乙二醇的拆分机理，整个去消旋过程是由(R)-苯基乙二醇次级醇脱氢酶和羰基还原酶共同催化完成的。第一步是由(R)-苯基乙二醇次级醇脱氢酶对(R)-苯基乙二醇不对称氧化，生成α-羟基苯乙酮，这是一步可逆的酶催化反应；第二步是羰基还原酶对α-羟基苯乙酮不对称还原反应，生成(S)-苯基乙二醇，这个酶催化反应为不可逆。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章绪论

第二章醇脱氢酶的分离纯化

第三章醇脱氢酶酶学性质的研究

第四章Candida parapsilosis CCTCCM203011中羰基还原酶的分离纯化

第五章羰基还原酶酶学性质的研究

主要结论

参考文献

致谢

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