近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)催化立体异构反应动力学及催化过程的研究

摘要

以外消旋化合物为底物的立体异构反应是手性生物合成中最重要和最具有工业应用前景的制备方法之一。本论文以近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC M203011催化立体异构反应制备具有重要工业用途的光学纯苯基乙二醇为模型反应，针对立体异构反应中普遍存在的底物浓度低和反应时间长等制约其工业应用的核心问题，利用动力学和热力学等表征催化特性的研究，在比对获得立体异构反应限制性因子的基础上，以催化特性为导向，在中试规模上对生物催化剂制备和反应过程进行研究，揭示了抑制立体异构反应效率的限制性因素，建立了酶水平的利用辅酶再生进行高效不对称还原制备苯基乙二醇两种光学纯对映体的途径，实现了中试规模下全细胞催化立体异构反应高效制备S-苯基乙二醇的制备。
　　 (1)分离纯化获得了催化立体异构反应中立体选择性氧化反应的苯基乙二醇脱氢酶，通过底物专一性和辅酶依赖型的研究发现，该酶只能够催化R-苯基乙二醇选择性氧化为羟基苯乙酮及其逆向不对称还原反应，其氧化反应速率与底物浓度相关，其中高浓度的醇类底物会对立体选择性氧化反应产生明显抑制；通过不同底物浓度下表观动力学参数Km’的变化趋势证实苯基乙二醇脱氢酶催化立体选择性氧化反应属于顺序型双底物反应模型；死巷抑制剂作用下的苯基乙二醇脱氢酶失活动力学研究表明在反应过程中按照苯基乙二醇脱氢酶、辅酶以及醇类底物的顺序进行结合；产物抑制动力学研究及双底物反应动力学方程拟合试验表明立体选择性氧化反应遵循Theorell-Chance Bi Bi机制；基于苯基乙二醇脱氢酶催化不对称还原反应能力的基础，通过与甲酸脱氢酶进行偶联，控制不对称还原反应方向，成功实现了酶法R-苯基乙二醇的制备，在底物浓度为60mmol·1-1时，10h产率分别达到95.8％，产物光学纯度均接近100％c.e.。
　　 (2)分离纯化获得了催化立体异构反应中不对称还原反应的羰基还原酶，通过底物专一性和辅酶依赖型的研究发现，该酶能够催化羟基苯乙酮不对称还原为S-苯基乙二醇，且该反应为不可逆反应，揭示了立体异构反应高转化率和高光学纯度的化学平衡基础，高浓度的底物羟基苯乙酮浓度不会对不对称还原反应速率产生抑制作用，而高浓度辅酶NADPH会对不对称还原反应反应产生明显抑制；通过不同底物浓度下表观动力学参数Km’的变化趋势证实羰基还原酶催化不对称还原反应属于顺序型双底物反应模型；产物抑制动力学研究以及双底物反应动力学方程拟合试验表明立体选择性氧化反应遵循Theorell-Chance Bi Bi机制；建立了羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶或6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联辅酶NADPH的反应体系，成功实现了酶法S-苯基乙二醇的制备，在底物浓度为60mmol·l-1时，10h产率分别达到91.3％和86.8％，产物光学纯度均接近100％e.e.。
　　 (3)通过氧化反应和还原反应稳态动力学参数和热力学参数的比较研究发现，无论是在最适作用条件下，还是在中性条件下，羰基还原酶催化不对称还原反应最大速率及催化效率均比苯基乙二醇脱氢酶催化的立体选择性氧化反应速率和催化效率高10倍以上，因此确定氧化反应是立体异构反应的限制性步骤；通过考察温度和pH等重要的环境因子对苯基乙二醇脱氢酶及羰基还原酶催化活性的影响研究，确定苯基乙二醇醇脱氢酶催化立体选择性氧化反应的最佳温度和pH分别为35℃和pH9.0，羰基还原酶催化不对称还原反应的最佳温度和pH分别为45℃和pH4.5，结果表明全细胞催化立体异构反应的两个关键蛋白存在不可调和性的矛盾，限制了立体异构反应的效率。
　　 (4)通过研究影响近平滑假丝酵母生长的培养基组成和培养条件，分别以发酵生物量和单位细胞具有的催化立体异构反应活性为指标，针对微生物催化活性具有重要影响金属离子，利用Plackett-Burman设计实验和响应面优化确定其最优组成；同时利用正交试验考察了影响生物催化剂发酵的培养条件；研究结果显示微生物的生物量与其具备的生物催化活性的非相关性；在最优发酵培养组成及最适发酵条件下，发酵获得生物量达到33.3g/L，立体异构反应产物光学纯度达到97.0％e.e．；
　　 (5)在7L发酵罐水平针对溶氧的研究表明通过调节搅拌转速和通气量提高溶氧水平有利于近平滑假丝酵母发酵生物量的提高，同时保持较好的催化活性：而150L中试规模微生物生长和催化活性的影响研究表明，过高的氧通量有利于微生物生长而不利于细胞催化活性的形成；通过调节搅拌转速和通气量等手段平衡了微生物生长与催化活性之间的矛盾，成功实现了150L中试规模高效生物催化剂发酵制备，发酵获得生物量达到47g/L，立体异构反应产物光学纯度达到99.3％e.e.。
　　 (6)通过对影响全细胞催化立体异构反应效率的环境因子研究，发现pH、温度、溶氧以及细胞量等环境因子对全细胞催化的立体异构反应影响与酶促反应不尽相同，通过反应条件优化，立体异构反应最适底物浓度达从35mmol·l-1提高至70mmol·l-1，产率和产物光学纯度分别达到90％和99％e.e.以上；基于立体异构反应稳态动力学研究中发现的限制性步骤立体选择性氧化反应在高底物浓度下存在的显著抑制作用，利用多种原位分离技术控制反应体系中的底物浓度，其中双水相体系和水-树脂两相反应体系最适底物浓度从70mmol·l-1提高至220mmol·l-1，产率和产物光学纯度分别达到90％和99％e.e.以上；并在公斤级中试规模实现了水-树脂两相体系中近平滑假丝酵母全细胞催化立体异构反应，48h产物光学纯度和产率分别达到99％e.e.和94％以上。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 概述

1.2 生物法制备手性醇类化合物的研究进展

1.3 生物催化立体异构反应研究进展

1.3.1 新生物催化剂的发现及新生物有机反应途径的建立

1.3.2 生物催化剂的分离纯化、酶学性质、构效关系以及分子定向改造研究

1.3.3 生物催化立体异构反应机理的研究

1.3.4 氧化还原酶催化不对称氧化还原反应动力学研究

1.3.5 纯酶水平偶联辅酶再生反应生物催化制备手性醇的研究

1.3.6 细胞水平上影响立体异构反应过程效率的研究

1.4 本课题研究内容

1.4.1 本课题研究目的和意义

1.4.2 本课题研究思路与内容

第二章 立体异构反应中立体选择性氧化反应稳态动力学研究

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌种与培养基

2.2.2 实验材料

2.2.3 主要仪器

2.2.4 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 苯基乙二醇醇脱氢酶的分离纯化

2.3.2 苯基乙二醇脱氢酶辅酶依赖性的确定及底物专一性研究

2.3.3 底物浓度对选择性氧化反应的影响

2.3.4 立体选择性氧化反应初速度的研究

2.3.5 死巷(Dead -end Inhibition)抑制试验

2.3.6 立体选择性氧化反应中产物抑制的研究

2.3.7 S-苯基乙二醇对立体选择性氧化反应的抑制作用研究

2.3.8 苯基乙二醇脱氢酶酶法偶联辅酶再生不对称还原制备R-苯基乙二醇的研究

2.4 本章小结

第三章: 立体异构反应中不对称还原反应稳态动力学研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 微生物与培养基

3.2.2 实验材料与主要仪器

3.2.3 实验方法

3.3 结果

3.3.1 羰基还原酶的分离纯化

3.3.2 羰基还原酶辅酶依赖性的确定及底物专一性研究

3.3.3 底物浓度对羰基还原酶催化不对称还原反应的影响

3.3.4 羰基还原酶催化不对称还原反应初速度的研究

3.3.5 羰基还原酶催化不对称还原反应中产物抑制的研究

3.3.6 羰基还原酶偶联辅酶再生不对称还原制备S-苯基乙二醇的研究

3.4 本章小结

第四章 环境因子对立体异构反应关键酶动力学及热力学的影响

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 氧化还原酶纯化方法

4.2.3 温度对氧化还原酶活力的影响

4.2.4 氧化还原酶半衰期的测定

4.2.5 其他测定方法及仪器

4.3 结果

4.3.1 不同pH条件下苯基乙二醇醇脱氢酶催化氧化反应动力学研究

4.3.2 不同pH条件下羰基还原酶催化还原反应动力学研究

4.3.3 温度对氧化还原酶活力的影响

4.3.4 温度对氧化还原酶稳定性的影响

4.3.5 不同pH条件下立体异构反应关键酶动力学和热力学参数的比较

4.4 本章小结

第五章 以催化特性为导向微生物催化剂制备工程研究

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌种

5.2.2 C. parapsilosis CCTCC M203011培养基

5.2.3 实验材料

5.2.4 主要仪器

5.2.5 实验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 碳源对近平滑假丝酵母发酵生物量以及催化效率的影响

5.3.2 氮源对近平滑假丝酵母发酵生物量以及催化效率的影响

5.3.3 培养基中碳氧比对近平滑假丝酵母发酵生物量以及催化效率的影响

5.3.4 金属离子对近平滑假丝酵母发酵生物量以及催化效率的影响

5.3.5 培养条件对近平滑假丝酵母发酵生物量以及催化效率的影响

5.3.6 发酵罐中溶氧对近平滑假丝酵母发酵生物量以及催化效率的影响

5.3.7 中试规模生物催化剂的制备

5.4 本章小结

第六章 基于动力学研究基础全细胞催化立体异构反应过程研究

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 实验材料

6.2.2 实验方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 底物浓度对全细胞催化立体异构反应效率的影响

6.3.2 反应pH值对全细胞催化立体异构反应效率的影响

6.3.3 反应温度对全细胞催化立体异构反应效率的影响

6.3.4 细胞固定化对全细胞催化立体异构反应效率的影响

6.3.5 反应体系溶氧对全细胞催化立体异构反应效率的影响

6.3.6 全细胞最适作用条件下反应过程的拟合

6.3.7 反应细胞量对转化效率的影响

6.3.8 利用原位分离方法解除底物抑制的研究

6.3.9 100L反应罐中树脂吸附反应体系中立体异构反应过程研究

6.4 本章小结

结论与展望

主要结论

研究展望

论文创新点

参考文献

附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文

致谢