L-赖氨酸产生菌选育及其发酵条件的调控

摘要

本文应用代谢控制发酵原理，系统地研究了L-赖氨酸产生菌LXQ-89的选育、代谢流量分析以及摇瓶发酵条件等，主要研究内容和结果如下：
　　 ⑴以黄色短杆菌(Brebvibacterium flavum)XQ-8为出发菌株，经化学和物理诱变处理，以高浓度葡萄糖、磺胺胍(SG)、高浓度赖氨酸乙酯盐酸盐(Lys-OEt)抗性平板以及缬氨酸(Val)缺陷平板定向筛选，成功选育出一株L-赖氨酸产生菌LXQ-89(Met-Thr-SucgAECrSGrVal-Lys-OEtr)。在以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的培养基中发酵72 h，产酸可达77 g/L。
　　 ⑵建立并完善了LXQ-8及其2个逐步叠加不同遗传标记的突变株LXQ-81和LXQ-89合成L-赖氨酸的中心代谢网络。分别测定了它们在特定培养时段(42～46 h)L-赖氨酸等代谢物的胞外浓度，由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累(或消耗)的速率，分别作出这3株菌在拟稳态下的代谢流量分布图，进而研究育种过程中不同遗传标记的叠加对代谢网络中L-赖氨酸合成流量分布的影响。结果表明遗传标记的引入使流量分配发生了重大变化，节点处的流量分配朝着有利于L-赖氨酸合成的方向改变。从代谢流量分析角度上，证明结构类似物抗性和缺陷型突变是代谢流导向和设计育种的有效手段，代谢流量分析为设计育种提供新思路。
　　 ⑶对菌株LXQ-89进行了培养基和发酵条件的优化，研究了在发酵培养基中添加乙酸和乙醇、在发酵过程中添加吐温-80和二甲基亚砜对赖氨酸发酵的影响。得到最佳的种子培养基(g/L):葡萄糖25、(NH4)2SO45、玉米浆35、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O0.5、CaCO315。种子最佳培养条件:pH7.0，装液量25 mL/250 mL三角瓶。最佳发酵培养基(g/L):葡萄糖170、(NH4)2SO455、玉米浆18.6、KH2PO41.2、MgSO4·7H2O0.6、Fe2+2mg/L、Mn2+2 mg/L、Met0.4、Thr0.4、Val0.2、乙酸6.3 mL/L、VH100μg/L、VB1200μg/L、CaCO345，在发酵20 h时添加3.2 g/L的吐温-80。摇瓶发酵最佳培养条件:选择种龄为11 h的菌体，初始pH为7.0，以10%接种量接入装液量25 mL/500 mL三角瓶，往复式摇床30℃，转速100 r/min，发酵周期72 h，优化后产酸可达95 g/L。
　　 ⑷结合菌株LXQ-89发酵过程曲线，对发酵过程中补加葡萄糖进行了初步的研究，结果表明:总糖为170 g/L，确定初糖为80 g/L，在发酵28 h补加45 g糖(对于1L的发酵液而言)，在44 h再补加剩下的45 g糖(对于1L的发酵液而言)，72 h产量达到最大值100 g/L，对赖氨酸的产量有一定的提高。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 引言

1.1 前言

1.2 L-赖氨酸的理化性质

1.3 L-赖氨酸的功能及应用

1.3.1 L-赖氨酸在食品工业中的应用

1.3.2 L-赖氨酸在饲料工业中的应用

1.3.3 L-赖氨酸在医药工业中的应用

1.4 L-赖氨酸的制备方法

1.5 发酵法生产L-赖氨酸的研究进展

1.6 L-赖氨酸的代谢控制育种

1.6.1 L-赖氨酸的生物合成调节机制

1.6.2 L-赖氨酸的育种途径

1.6.3 L-赖氨酸产生菌育种的育种技术难题和应对策略

1.7 本论文的研究内容

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 出发菌株

2.1.2 主要试剂和仪器

2.1.3 培养基

2.2 方法

2.2.1 培养方法

2.2.2 诱变方法

2.2.3 筛选方法

2.2.4 分析方法

第三章 结果与讨论

3.1 L-赖氨酸产生菌的选育

3.1.1 出发菌株遗传标记的鉴定

3.1.2 活菌数量与OD值之间的关系

3.1.3 生长曲线的测定及诱变用细胞培养时间的确定

3.1.4 诱变剂量和时间的确定

3.1.5 L-赖氨酸产生菌的选育结果

3.1.6 菌株LXQ-89的遗传稳定性实验

3.2 L-赖氨酸生物合成的代谢流量分析

3.2.1 L-赖氨酸合成的途径

3.2.2 L-赖氨酸形成阶段各菌株的胞外代谢产物浓度的测定

3.2.3 L-赖氨酸形成阶段各菌株的代谢流量分配的计算

3.2.4 出发菌株LXQ-8与其突变株代谢流分析结果比较

3.3 L-赖氨酸发酵条件的调控

3.3.1 种子培养基及其培养条件的优化

3.3.2 发酵培养基及其培养条件的优化

3.4 分批补加葡萄糖发酵的研究

3.4.1 初糖浓度的确定

3.4.2 补糖时间的确定

3.4.3 分批补料发酵的过程曲线

3.5 主要结论

3.6 展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文