叶酸途径对谷氨酸棒杆菌SYPS-062积累L-丝氨酸的影响分析

摘要

叶酸是体内L-丝氨酸降解途径中的重要辅酶，对细胞内一碳单元循环及细胞增殖至关重要。本论文初步研究了叶酸代谢途径对谷氨酸棒杆菌SYPS-062生长及产L-丝氨酸的影响，并初步探讨了菌株SYPS-062叶酸代谢途径中的相关基因的表达对其L-丝氨酸积累的影响。
　　 本论文通过内、外源扰动实验考察了叶酸途径对菌株SYPS-062中L-丝氨酸代谢的影响。外源添加磺胺、氨甲喋呤、叶酸、对氨基苯甲酸扰动叶酸代谢途径研究叶酸代谢在产酸菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062中的作用；内源调控则运用反义RNA技术下调控叶酸合成关键酶基因pabAB的表达以及增强表达该基因。磺胺与氨甲喋呤扰动实验表明:叶酸途径的抑菌剂能抑制谷氨酸棒杆菌SYPS-062生长并提高其单位产酸能力；而对氨基苯甲酸能够促进细菌的生长并显著降低其产酸能力；但叶酸添加实验显示，在添加的浓度范围内菌体生长没有得到促进，反而高浓度的叶酸不利于其生长，表明该菌能自身合成叶酸时，即不从外源摄取叶酸。随后磺胺与对氨基苯甲酸扰动后代谢通量的分析充分证明了作为调控点的叶酸途径在SYPS-062生长及积累L-丝氨酸中占主导地位。
　　 论文还比较了谷氨酸棒杆菌SYPS-062及模式菌株ATCC13032叶酸合成途径关键酶的编码基因pabAB的异同。实验结果表明，pabAB基因序列和模式菌株ATCC13032的同源性为99.14%，有16个碱基的差异，存在7个氨基酸的差异。运用反义RNA技术内源性地下调控pabAB基因的表达，结果表明构建的基因工程菌与原始相比生长速率缓慢，而L-丝氨酸产量有所提高。
　　 两种不同来源的pabAB基因在大肠杆菌中表达并测得重组蛋白的比活力，产酸菌氨基脱氧分支酸合成酶的比活力比模式菌株低了46.6%，说明谷氨酸棒杆菌SYPS-062细胞内L-丝氨酸降解途径中丝氨酸羟甲基转移酶的辅酶水平可能低于模式菌株，降解的减少极可能是谷氨酸棒杆菌SYPS-062积累L-丝氨酸的主要原因，同时低水平叶酸也是谷氨酸棒杆菌SYPS-062生长缓慢延滞期长的原因。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 L-丝氨酸的性质及其应用

1.1.1 L-丝氨酸的生物学性质

1.1.2 L-丝氨酸的应用

1.2 L-丝氨酸的生产概况

1.2.1 蛋白质水解提取法

1.2.2 化学合成法

1.2.3 酶转化法

1.2.4 微生物发酵法

1.3 直接利用糖质原料发酵产L-丝氨酸的国内外研究进展

1.3.1 国外研究进展

1.3.2 国内研究进展

1.4 叶酸的性质及生物学意义

1.5 叶酸代谢途径

1.6 代谢工程

1.7 本课题的立题意义及研究内容

1.7.1 立题意义

1.7.2 研究内容

第二章 材料与方法

2.1 菌株与质粒

2.2 培养基与培养条件

2.2.1 培养基

2.2.2 培养条件

2.3 主要试剂与工具酶

2.3.1 生化试剂

2.3.2 蛋白质相关试剂

2.3.3 工具酶

2.3.4 抗生素的配制

2.3.5 溶菌酶

2.3.6 IPTG溶液配制

2.3.7 SDS-PAGE电泳试剂的配制

2.3.8 SDS-PAGE电泳凝胶的配制

2.3.9 镍琼脂糖凝胶FF亲和色谱分离缓冲液的配制

2.4 主要仪器

2.5 实验方法

2.5.1 分析方法

2.5.2 最低抑菌浓度实验

2.5.3 胞内叶酸检测

2.5.4 代谢通量分析

2.5.5 谷氨酸棒杆菌的染色体DNA的提取

2.5.6 SYPS-062及ATCC13032的pabAB基因的扩增，及SYPS Anti-pabAB基因扩增

2.5.7 大肠杆菌感受态的制备及转化

2.5.8 基因片段与载体pMD19-T Vector、pET-28a、pJC-tac的连接

2.5.9 大肠杆菌重组质粒的抽提

2.5.10 重组质粒中插入片段的序列测定及序列比对

2.5.11 谷氨酸棒杆菌SYPS-062感受态制备及电转

2.5.12 重组表达质粒的诱导表达

2.5.13 重组酶蛋白的纯化

2.5.14 重组氨基脱氧分支酸合成酶的酶活测定

第三章 结果与讨论

3.1 外源小分子扰动调控叶酸途径的初步分析

3.1.1 叶酸途径抑制剂的扰动实验

3.1.2 叶酸途径中间产物的扰动实验

3.2 磺胺、对氨基苯甲酸扰动后的分析

3.2.1 磺胺、对氨基苯甲酸扰动后发酵曲线的比较分析

3.2.2 磺胺、对氨基苯甲酸扰动后代谢通量比较分析

3.3 内源调控叶酸途径的分析结果

3.3.1 叶酸合成途径关键基因的克隆分析

3.3.2 SYPS-062的pabAB基因胞内表达对其生长及产酸影响

3.3.3 不同来源的pabAB片段在大肠杆菌内的诱导表达及酶活性质比较分析

第四章 结论与展望

致谢

参考文献

附录