基于免疫反应的高灵敏检测方法的建立

摘要

由于量子点及碳纳米管(CNTs)独特的纳米特性及生物兼容性，它们在免疫分析领域被广泛应用。本论文分别构建了两种基于免疫反应的高灵敏检测方法。基于聚合量子点的超灵敏免疫印迹方法(western blot)用以对复杂蛋白样品进行分析检测，碳纳米管一纸免疫传感器对水中的微囊藻毒素进行检测。
　　 一种免疫方法是：基于量子点的超灵敏蛋白检测免疫印迹方法。碲化镉(CdTe)量子点由于它独特的光学及生物特性，被广泛应用于生物化学标记领域。本论文构建了一种基于量子点的超灵敏蛋白检测免疫印迹方法。由于亲和素功能化的聚合量子点的高亲和性及对检测步骤的简化，使得量化免疫印迹方法成为现实。为了制备聚合量子点，首先需要用生物素化的变性牛血清白蛋白(dBSA)包裹量子点，然后通过生物素与亲和素的相互作用，量子点相互偶联生成聚合量子点。经过一系列的修饰，碲化镉量子点的荧光强度显著增强。把聚合量子点作为免疫印迹的标志物，其追踪微量蛋白比传统染料更灵敏。以蛋白A为例，对基于聚合量子点的免疫印迹方法进行验证，检测线性范围为30pg到1.5ng，检测限达0.84pg。最终在聚偏二氟乙烯膜上的荧光信号至少可以保持40min。进行实际样品检测时，回收率达99.9％到103.0％。
　　 另一种方法是纸—单壁碳纳米管复合物组成的，简单且高效的传感器。碳纳米管传感器的电阻取决于碳纳米管网络之间的间隙宽度，该方法能很好的满足常规毒素的检测要求。本论文对微囊藻毒素进行了检测并建立了标准曲线，线性范围为1.25nmol/L到10nmol/L。检测限达0.6hmol/L(0.6ng/mL)，满足了世界卫生组织关于饮用水中微囊藻毒素含量不超过lng/mL的检测要求。同时，论文还对该方法与ELISA检测方法进行了比较。

目录

文摘

英文文摘

声明

一、绪论

1.1量子点概论

1.1.1量子点的性质

1.1.2量子点的应用

1.2碳纳米管概述

1.2.1碳纳米管的性质

1.2.2碳纳米管的应用

1.3免疫印迹及电化学分析方法

1.3.1免疫印迹方法

1.3.2电化学分析方法

1.4本课题研究内容、目标

1.4.1研究内容

1.4.2研究目的

二、实验材料及方法

2.1实验材料

2.1.1实验药品

2.1.2主要溶液

2.1.3实验仪器

2.2基于量子点的免疫印迹新方法的实验步骤

2.2.1 BSA的还原变性

2.2.2 dBSA的琥珀酰胺生物素化(NHS-biotin-dBSA的制备)

2.2.3生物素化的变性BSA包裹量子点

2.2.4亲和素化荧光量子团的制备

2.2.5 SDS-PAGE变性凝胶电泳

2.2.6 Western blotting转移蛋白

2.2.7蛋白质鉴定(免疫检测)

2.2.8优化实验

2.2.9标准曲线的建立

2.2.10实际样品检测及回收率计算

2.2.11检测限的计算

2.2.12与商品化试剂盒的比较

2.3碳纳米管在免疫传感器中的应用实验步骤

2.3.1电极的制作

2.3.2微囊藻毒素的电化学检测

2.3.3扫描电镜(SEM)与原子力显微镜(AFM)

2.3.4优化实验

2.3.5对照试验

2.3.6添加回收率的计算

2.3.7检测限的计算

2.3.8 ELISA检测步骤

三、实验结果与讨论

3.1基于聚合量子点的免疫印迹新方法的实验结果及讨论

3.1.1 dBSA的琥珀酰胺生物素化鉴定

3.1.2生物素化的dBSA包裹量子点结果鉴定

3.1.3聚合量子点的生成

3.1.4条件优化

3.1.5标准曲线的建立

3.1.6荧光保留时间

3.1.7实际样品检测及添加回收率的计算

3.1.8与商品化试剂盒的比较

3.2碳纳米管在免疫传感器中的应用实验结果及讨论

3.2.1电极制作

3.2.2扫描电镜(SEM)与原子力显微镜(AFM)表征

3.2.3电极电阻值的测定

3.2.4条件优化

3.2.5标准曲线的建立

3.2.6添加回收率的计算

主要结论

致谢

参考文献

附录： 作者在攻读硕士学位期间发表的论文