洋葱布克氏菌(Burkholderia cepacia)全细胞不对称拆分dl-薄荷醇研究

摘要

薄荷醇是世界三大香料之一，是一种重要的手性中间体，广泛应用在化妆品、食品、香料等工业中。使用生物催化剂催化合成化学品的工业生产已经被视为一种环保的合成方法。全细胞生物拆分dl-薄荷醇与化学法合成薄荷醇相比具有反应条件温和、环保、高效等优点，必将拥有广阔的前景，是一种理想的拆分薄荷醇工业化生产方式。本文以洋葱布克氏菌(Burkholderia cepacia ATCC25416)全细胞不对称拆分dl-乙酸薄荷酯为研究对象，对在7L发酵罐上的发酵和转化、产物对反应的抑制的解除、生物催化剂稳定性、产物的分离提取进行研究，旨在为生物法生产l-薄荷醇的工业化放大奠定一定的基础。具体内容包括:
　　 对7L罐中发酵产酶体系进行了研究。结果表明，由于体系的放大，菌体环境的改变，对依赖的发酵条件产生了变化。通过对7L罐发酵条件的优化与选择，解决了罐发酵过程中严重产泡而造成的逃液现象，并且有效地提高了菌体量以及酶活。最终确定7L罐上发酵条件为葡萄糖40 g/L，牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，NaNO320 g/L，K2HPO44 g/L，MgSO4·7H2O0.2 g/L，CaCl20.1 g/L；控制体系pH7.5；搅拌速率控制在400 r/min；通气量为6 L/min；培养发酵时间48 h。在此条件下进行的7L罐发酵产酶，酶活从200U/L提高到298 U/L，为摇瓶水平酶活的149%；菌体量由摇瓶水平的4.7 g/L提高到了9.8 g/L，提高了将近100%。
　　 对利用原位吸附来减弱产物抑制从而提高底物浓度进行了研究。结果表明反应体系中添加树脂H2-845可以有效地吸附水解反应过程中产生的薄荷醇，极大的减弱了产物对反应的抑制作用。建立了树脂添加量随底物浓度变化的关系式，通过公式添加树脂将溶液中产物总浓度控制在最适水平。通过对原位吸附反应体系进行了优化，从而实现高底物浓度反应。最后在60 g/Ld/-乙酸薄荷酯浓度转化反应体系反应2h后添加0.34 g树脂，反应24 h，产物l-薄荷醇的e.e.值和产率达到98%和45%，比优化前反应的dl-乙酸薄荷酯浓度提高了500%。
　　 对称拆分dl-乙酸薄荷酯产l-薄荷醇反应体系的条件进行了考察研究。确定了最适合的反应条件，在密闭的条件下，控制转化体系pH7.0，底物浓度为60 g/L，细胞浓度为160 g/L，温度30℃，搅拌速率为250 r/min，转化反应时间为24 h。在此条件下，转化率达46%，产物e.e.值为98.6%，达到了原先1 mL反应体系的反应水平。
　　 对产物l-薄荷醇进行了分离纯化的研究。确定产物l-薄荷醇的纯化步骤为吸附、解吸附、浓缩、柱层析和重结晶。用树脂HZ-845对l-薄荷醇进行吸附，用乙酸乙酯对吸附上的产物进行解吸附。经过几步纯化，最终所得产物l-薄荷醇光学纯度保持在99%以上，总收率为64.3%。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1 立题意义

1.2 国内外研究进展

1.2.1 国际上制备l-薄荷醇的研究现状

1.2.2 生物法不对称拆分dl-薄荷醇的国内外研究进展

1.2.3 原位分离技术

1.2.4 生物催化过程对催化剂的要求

1.3 本课题研究的主要目的和内容

第二章 实验材料与方法

2.1 试剂和仪器

2.2 实验方法

2.2.1 Burkholderia cepacia ATCC25416 培养基

2.2.2 菌体培养方法

2.2.3 树脂的预处理

2.2.4 树脂对底物吸附量的测定

2.2.5 洋葱布克氏菌不对称拆分dl-薄荷醇反应

2.2.6 气相分析方法

2.2.7 产物分析方法

2.2.8 酶活测定方法

2.2.9 树脂对产物的吸附和解吸附

第三章 结果与讨论

3.1 洋葱布克氏菌发酵体系的放大研究

3.1.1 葡萄糖浓度对B.cepacia ATCC 25416菌体生长及产酶的影响

3.1.2 添加无机氮源对B.cepacia ATCC 25416菌体生长及产酶的影响

3.1.3 pH对发酵B.cepacia ATCC 25416菌体生长及产酶的影响

3.1.4 搅拌速率对发酵培养的影响

3.1.5 通气量对B.cepacia ATCC 25416菌体生长及产酶的影响

3.1.6 发酵培养时间对B.cepacia ATCC 25416菌体生长及产酶的影响

3.2 树脂原位吸附促进高浓度底物不对称拆分dl-薄荷醇的研究

3.2.1 高浓度产物对不对称拆分反应的抑制

3.2.2 不同树脂对dl-薄荷醇的吸附

3.2.3 添加不同树脂对高浓度底物转化反应效率的影响

3.2.4 不同时间添加树脂对转化反应的影响

3.2.5 不同菌体添加量对转化效果的影响

3.2.6 底物浓度对转化反应的影响

3.2.7 各底物浓度下最适树脂添加量

3.2.8 菌体B.cepacia ATCC 25416批次稳定性研究

3.3 B.cepacia菌整细胞催化高浓度dl-乙酸薄荷酯水解反应体系放大研究

3.3.1 pH对1L体系转化反应的影响

3.3.2 助溶剂二甲亚砜对1L体系转化反应的影响

3.3.3 搅拌速率对1L体系转化的影响

3.4 l-薄荷醇的分离纯化

3.4.1 分离提纯步骤的确定

3.4.2 吸附曲线

3.4.3 转化液中产物薄荷醇的吸附和解吸附

3.4.4 产物分离提纯最终得率

3.4.5 l-薄荷醇品质鉴定

主要结论和展望

致 谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文