酶膜耦联反应制备酪蛋白抗氧化肽的工艺研究

摘要

酶法制备具有生物活性的蛋白水解物及其在食品工业中的应用正受到越来越多的重视。传统的蛋白酶水解方式是间歇式，存在着酶不能重复利用、灭酶可能导致不良产物产生等缺点，将超滤技术和酶解反应器结合起来，可以实现小分子量水解物从酶解产物中的连续分离，是一种新型的活性肽生产方法。本文应用酶膜耦联反应(EmzymaticMembrane Reactor，EMR)水解酪蛋白制备其抗氧化肽。
　　 首先，从七种蛋白酶中筛选获得酶解产物抗氧化活性和水解能力较强的四种蛋白酶：AS1,398中性蛋白酶、Alcalase2.4L碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。将以上四种酶用于EMR，通过DPPH自由基清除率、产物转化率、产物分子量分布以及氨基酸分析，确定AS1,398中性蛋白酶作为EMR酶源。通过单因素和响应面回归分析得到酶解反应水解最适条件：采用AS1,398中性蛋白酶为酶源，酪蛋白浓度30g/L，水解时间90min，温度50℃，加酶量2％(w/w)，pH7.2。最优酶解条件下，10mg/mL水解产物的DPPH自由基清除率为80.43±0.47％。显示出较好的抗氧化能力。
　　 根据酶解产物分子量分布对膜截留分子量进行选择，选定3kDa、5kDa和10kDa三种不同截留分子量的改良聚醚砜超滤膜。在最优酶解条件，压力为30kPa下，分别使用以上三种截留分子量的膜制备酪蛋白抗氧化肽，结果显示：通过10kDa膜的渗透液流量为11.52mL/min，透过产物DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基清除率的半抑制浓度分别为5.37、5.15和1.21mg/mL，均高于其他两种截留分子量膜的效果。故选择10kDa截留分子量的超滤膜堆应用于本酶膜耦联反应中。
　　 为研究酶膜耦联反应操作条件对透过液产物的影响，从边界层阻力模型得到膜固有阻力RM=0.34minkPa/mL和极化层阻力RG=1.23minkPa/mL，确定了物料在EMR中变化趋势。以透过产物抗氧化活性、转化率和透过液流量为指标，研究压力、初始底物浓度和初始酶浓度对透过液的影响。结果表明压力25～30kPa，初始底物浓度30g/L，初始加酶量为2.0～2.5％时所得抗氧化肽活性最强。其渗透流量为11.63±0.18mL/min，DPPH自由基清除率为67.1±0.95％，转化率为59.91±3.45％。
　　 研究EMR操作条件下透过液产物对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力得到结果分别为：4.89mg/mL，5.13mg/mL和1.13mg/mL。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩写符号说明

声明

1绪 论

1.1酪蛋白生物活性肽的研究现状

1.2抗氧化生物活性肽的研究进展

1.3活性肽制备途径和方法

1.3.1间歇式水解

1.3.2固定化酶

1.3.3酶膜反应器

1.4国内外酶膜反应器在食品工业中的应用

1.5立题背景和依据

1.6主要研究内容

2实验方法与材料

2.1实验材料

2.1.1实验原料

2.1.2主要试剂

2.2实验仪器与设备

2.3实验方法

2.2.1蛋白酶解工艺

2.2.2蛋白质水解度的测定

2.2.3渗透流量的测定

2.2.4边界层阻力模型

2.2.5膜分离过程中膜性质的评价

2.2.6蛋白质转化率

2.2.7抗氧化活性的测定

2.2.8蛋白质或多肽的疏水值的测定

2.2.9相对分子质量分布测定

2.2.10氨基酸组成的测定

2.2.11数据统计与分析

3实验结果与讨论

3.1酶源的确定

3.1.1酶解反应

3.1.2酶膜耦联反应

3.2酶解工艺研究

3.2.1底物浓度对水解度和抗氧化活性的影响

3.2.2 pH对水解度和抗氧化活性的影响

3.2.3酶底比对水解度和抗氧化活性的影响

3.2.4温度对水解度和抗氧化活性的影响

3.2.5响应面优化

3.3膜工艺研究

3.3.1膜组件的选择

3.3.2膜截流分子量确定

3.3.3膜透过酶解产物的抗氧化活性

3.3.4膜阻力模型

3.3.5压力对透过液的影响

3.3.6初始底物浓度对透过液的影响

3.3.7初始酶浓度对透过液的影响

3.4酶解产物的抗氧化性

3.4.1还原力的测定

3.4.2酶解产物的DPPH自由基清除能力

3.4.3酶解产物的羟基自由基清除能力

3.4.4酶解产物的超氧阴离子清除能力

3.5酶解产物抗氧化稳定性

3.5.1酶解产物酸碱稳定性

3.5.2酶解产物热稳定性

3.5.3酶解产物贮藏稳定性

主要结论

致 谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文