α-环糊精以及γ环糊精的酶转化工艺研究

摘要

环糊精(Cyclodextrins,通常简称为CD),是一类由淀粉或多糖在环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glyeosyltransferas,简称CGTase,EC2.4.1.19)作用下生成的由D-吡喃葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键首尾相连的环状化合物的总称,常见的有α、β-和γ-环糊精。由于环糊精能与许多客体分子形成包合物,从而改变客体分子的物理和化学性质如溶解度、稳定性等,因此在食品、医药、农业、纺织、环保、化妆品、生物技术和分析化学等领域具有广泛的应用。
　　 工业化生产环糊精主要是通过酶法生产,但目前国内尚未有旺α-、γ-环糊精的酶法生产工艺报道。本论文以实验室开发的具有自主知识产权的α-CGTase与γ-CGTase为基础,较为系统地研究了α-、γ-环糊精的酶法生产工艺,为α、γ-环糊精工业化生产奠定理论基础。论文的主要研究如下:
　　 1.对来源于Peanibacillus macerans JFB05-01的重组α-CGTase突变体Y89D制备α-环糊精的影响因素进行了研究,其中包括反应时间,淀粉种类(马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、可溶性淀粉),加酶量,温度,pH,有机溶剂(乙醇、异丙醇、正丁醇、正癸醇),底物浓度和加酶方式等,结果表明:选用15％马铃薯淀粉,pH5.0,温度30℃,反应体系中加入5％的正癸醇,采用两次添加α-CGTase并使总加酶量控制在5U/g淀粉左右的加酶方式,反应时间6 h,环糊精转化率可达55％(w/w),其中α-环糊精约占87％,β-环糊精占13％,只有极少量的γ-环糊精生成。
　　 2.研究了α-环糊精的分离提取工艺,反应液经水蒸气蒸馏、浓缩、结晶、干燥最终获得α-环糊精成品,经HPLC检测,提取收率可达90％-95％,α-环糊精纯度达到98％。产品经气相色谱检测,正癸醇的残余量为3.0 ppm,符合产品安全生产的要求。
　　 3.对来源于Alkalophilic Bacillus clarkii7364的γ-CGTase制备γ-环糊精的工艺进行了研究,其中包括反应时间、淀粉种类、加酶量、温度、pH、有机溶剂、底物浓度和加酶方式等,从而确定γ-环糊精生产的最佳工艺为:15％可溶性淀粉淀粉,pH12.0,温度55℃,反应体系中加入2％的甘草酸,采用两次添加γ-CGTase并使总加酶量控制在5U/g淀粉左右的加酶方式,反应时间6 h,环糊精转化率可达66.7％(w/w),其中γ-环糊精在产物中约占95％,β-环糊精占5％的,几乎没有α-环糊精。
　　 4.初步研究了γ-环糊精的分离提取工艺,比较大孔吸附树脂吸附法和酸沉淀法两种分离方法,结果表明酸沉淀法分离效果较好,体系中56％的甘草酸得以去除,该研究为进一步分离纯化精制γ-环糊精提供了借鉴依据。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 环糊精概述

1.1.1 环糊精的组成和结构

1.1.2 环糊精的理化性质

1.1.3 环糊精的应用

1.2 环糊精的生产及研究概况

1.2.1 环糊精的生产概况

1.2.2 CGTase的制备

1.2.3 环糊精的生产工艺

1.2.4 环糊精国内外生产的研究概况

1.3 本课题立题依据和意义

1.4 本课题主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 粗酶液制备

2.3.2 α-CGTase活力的测定

2.3.4 γ-CGTase活力的测定

2.3.5 环糊精含量测定

2.3.6 DE值测定

2.3.7 α-CGTase作用淀粉产α-环糊精影响因素研究

2.3.8 α-环糊精的提取工艺

2.3.9 γ-CGTase作用淀粉产γ-环糊精影响因素研究

2.3.10 γ-环糊精的分离提取工艺

第三章 结果与讨论

3.1 α-CGTase作用淀粉产α-环糊精影响因素研究

3.1.1 野生酶与突变体Y89D生产环糊精的比较

3.1.2 淀粉种类对α-环糊精生产的影响

3.1.3 加酶量对α-环糊精生产的影响

3.1.4 温度对α-环糊精生产的影响

3.1.5 pH对α-环糊精生产的影响

3.1.6 有机溶剂对α-环糊精生产的影响

3.1.7 有机溶剂浓度对α-环糊精生产的影响

3.1.8 马铃薯淀粉浓度对α-环糊精生产的影响

3.1.9 加酶方式α-环糊精生产的影响

3.1.10 小结

3.2 α-环糊精的提取工艺

3.2.1 α-环糊精的分离提取

3.2.2 α-环糊精的鉴定分析

3.2.3 小结

3.3 γ-CGTase作用淀粉产γ-环糊精影响因素研究

3.3.1 反应时间对γ-环糊精生产的影响

3.3.2 淀粉种类对γ-环糊精生产的影响

3.3.3 温度对γ-环糊精生产的影响

3.3.4 pH对γ-环糊精生产的影响

3.3.5 加酶量对γ-环糊精生产的影响

3.3.6 有机溶剂对γ-环糊精生产的影响

3.3.7 有机溶剂浓度对γ-环糊精生产的影响

3.3.8 底物浓度对γ-环糊精生产的影响

3.3.9 加酶方式对γ-环糊精生产的影响

3.3.10 小结

3.4 γ-环糊精的提取分离工艺

3.4.1 大孔吸附树脂分离甘草酸与γ-环糊精

3.4.2 酸沉淀法分离甘草酸与γ-环糊精

3.4.3 小结

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文