乙酰辅酶A对酿酒酵母生理代谢的影响

摘要

乙酰辅酶(AcCoA)是生物细胞内一种重要的辅因子,直接参与了包括三羧酸循环、氨基酸代谢、脂类代谢、萜类代谢在内的数百个生化反应。本论文以模式微生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为研究对象,研究了以下三个方面内容:以S.cerevisiae为研究对象构建乙酰辅酶A合成酶基因ACS1、ACS2过量表达菌株并在产物和酶活水平对过量表达菌株进行验证;研究过量表达乙酰辅酶A合成酶基因后S.cerevisiae副产物代谢的变化、细胞膜代谢途径关键基因转录、能量代谢变化、以及全基因组转录变化情况和重要代谢途径转录表达验证情况;研究了过量表达乙酰辅酶A合成酶基因后S.Cerevisiae对外界环境乙醇胁迫的应答变化情况,并从转录水平、能量代谢变化情况等角度阐述过量表达乙酰辅酶A合成酶基因增强S.cerevisiae对乙醇耐受性的机制,具体研究结果如下:
　　 (1)通过分子生物学手段对S.cerevisiae细胞中的乙酰辅酶A合成酶基因片段(ACS1、ACS2)进行扩增,通过酶切连接将乙酰辅酶A合成酶基因片段连接到真核穿梭表达载体pY26-GPD-TEF上,并利用化学转化法将表达载体pY26-GPD-TEF-ACS1、pY26-GPD-TEF-ACS2分别转化到S.cerevisiae。以含空载体pY26-GPD-TEF的S.Cerevisiae菌株作为对照,对胞内乙酰辅酶A含量和乙酰辅酶A合成酶活性的分析表明,过量表达ACS1和ACS2的菌株胞内乙酰辅酶A含量和乙酰辅酶A合成酶活性分别是对照的1.62和1.41倍;过量表达ACS2和ACS1的菌株胞内乙酰辅酶A含量分别是对照菌株的5.02和2.19倍。
　　 (2)利用HPLC、GC-MS、荧光定量PCR、基因芯片等技术研究过量表达乙酰辅酶A合成酶基因后S.cerevisiae细胞内能量代谢变化情况、细胞膜脂代谢变化情况和细胞全基因组转录变化情况。与对照菌株相比较过量表达ACS1的菌株细胞内能量代谢水平显著提高,胞内ATP含量是对照菌株的3.93倍;过量表达乙酰辅酶A合成酶基因后S.Cerevisiae甲羟戊酸代谢途径、不饱和脂肪酸合成代谢途径和甾醇代谢途径的关键基因转录发生了显著的上调变化。其中,甲羟戊酸途径关键转录表达显著上调,不饱和脂肪酸和甾醇生物合成途径相关基因的转录受到强烈抑制。
　　 (3)利用亚甲基蓝活菌染色技术、HPLC、GC-MS、荧光定量PCR、基因芯片等技术研究了过量表达ACS1/2后S.cerevisiae细胞在不同浓度乙醇胁迫条件下的生长情况,并从能量代谢、关键途径基因转录变化和全基因组转录变化情况等角度阐述了S.Cerevisiae过量表达ACS1/2后对不同浓度乙醇产生抗性的机制。相比于对照菌株,过量表达ACS1和ACS2显著提高了S.cerevisiae细胞对乙醇胁迫的耐受性;尽管相比于无乙醇胁迫条件下ATP含量均有所下降,但相同浓度乙醇胁迫条件下过量表达ACS1菌株细胞内ATP含量是对照的12.4倍;对照菌株在5％乙醇胁迫下,关键基因转录下调,而过量表达ACS1的菌株甾醇代谢途径、甲羟戊酸代谢途径和不饱和脂肪酸代谢途径的关键基因在转录水平有显著上调,此研究结果表明,过量表达ACS1的菌株出现对较高浓度乙醇胁迫的抗性的原因是多方面综合的转录调节过程,其中又以膜脂代谢前体物质和膜脂代谢途径的转录调节为重点。基因芯片的结果从侧面验证了出现乙醇抗性后S.Cerevisiae细胞对这一胁迫做出的综合应答,基因芯片结果表明,过量表达ACS1的菌株面对5％乙醇胁迫时脂类代谢和氨基酸代谢的变化最为显著。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

1.1 研究背景

1.1.1 乙酰辅酶A及其衍生物简述

1.1.2 乙酰辅酶A代谢

1.1.3 S.cerevisiae乙酰辅酶合成酶

1.1.4 调控细胞内乙酰辅酶A含量在工业生产中重要的作用

1.2 立题依据

1.2.1 乙酰辅酶A的国内外研究概况

1.2.2 本课题的研究意义

1.3 研究内容

第二章 材料与方法

2.1 菌种和培养基

2.1.1 菌种与质粒

2.1.2 培养基

2.2 培养方法

2.2.1 培养条件

2.3 表达载体的构建

2.3.1 DNA操作

2.3.2 表达载体和过量表达菌株的构建

2.3.3 细胞中总蛋白的测定

2.4 细胞内乙酰辅酶A含量和乙酰辅酶A合成酶活力的测定

2.5 细胞内ATP含量的测定

2.6 细胞代谢副产物的测定

2.7 细胞死亡率的测定

2.8 细胞内游离氨基酸的测定

2.9 关键代谢途径基因转录的测定

2.10 基因芯片技术检测细胞全基因组转录变化情况

第三章 结果与讨论

3.1 乙酰辅酶A合成酶基因过量表达菌株的构建与鉴定

3.1.1 过量表达载体的构建

3.1.2 过量表达ACS1和ACS2的过量表达菌株的构建

3.1.3 过量表达乙酰辅酶A合成酶后细胞内乙酰辅酶A合成酶活性变化情况

3.1.4 过量表达乙酰辅酶A合成酶基因后S.cerevisiae细胞内乙酰辅酶含量变化

3.2 过量表达乙酰辅酶A合成基因后S.cerevisiae生理代谢的变化情况

3.2.1 过量表达乙酰辅酶A合成酶基因后细胞氨基酸代谢变化情况

3.2.2 过量表达乙酰辅酶A合成酶基因后细胞能量代谢变化情况

3.2.3 过量表达乙酰辅酶A合成酶基因甲羟戊酸代谢途径转录变化

3.2.4 不同浓度乙酸对过量表达菌株甲羟戊酸代谢途径转录的影响

3.2.5 过量表达ACS1后细胞全基因组转录变化情况

3.3 过量表达乙酰辅酶A合成酶基因后细胞对乙醇胁迫的抗性变化情

3.3.1 不同浓度乙醇胁迫对乙酰辅酶A合成酶途径加强菌株生长代谢的影响

3.3.2 过量表达ACS1/2菌株在不同浓度乙醇胁迫下能量代谢变化情况

3.3.3 过量表达ACS1/2菌株在不同浓度乙醇胁迫下副产物变化情况

3.3.4 过量表达ACS1/2菌株在5%乙醇胁迫下关键途径基因转录变化情况

3.3.5 对照菌株和表达ACS1/2菌株在5%乙醇胁迫下全基因组转录变化情况

3.4 结论

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文