酿酒酵母NADH激酶Pso5p在细胞抵抗氧化胁迫中的作用

摘要

NADPH是生物体的一种重要辅酶,它不仅为生物合成反应提供还原力,而且对于细胞抵抗活性氧(ROS)的毒害也有重要作用。酿酒酵母POS5基因编码线粒体NADH激酶,是线粒体NADPH的主要供应者,对于线粒体一些功能的维持起到重要作用,其缺失会导致细胞抗氧化性能出现障碍,呼吸功能呈现部分缺陷。但是目前对于pos5A抗氧化功能障碍和呼吸缺陷的原因还未见详细报道。
　　 为了揭示酿酒酵母线粒体NADH激酶Pos5p与细胞抗氧化系统之间的关系,我们分析了pos5A和几种关键的抗氧化基因突变体的氧化胁迫生长表型和胞内ROS浓度。结果显示,Pos5p对抵抗三种不同类型的氧化胁迫因子(甲萘醌VK3、H2O2和马来酸二乙酯DEM)均有明显的作用,而抗氧化酶只对抵抗其相应的氧化胁迫因子有作用;POS5缺失后胞内ROS水平明显升高,回补体ROS水平降低,抗氧化基因双突变体sod2glr1△和trr2glr1△的ROS水平虽有升高,但略低于pos5△;在不同胁迫因子VK3、G2O2和DEM作用下,Pos5p也都能对ROS的清除起到不同程度的作用。证实Pos5p对细胞抵抗多种类型的氧化胁迫因子和对清除胞内ROS都有显著作用。
　　 为了了解Pos5p的抗氧化作用是否与它对辅酶NAD(H)和NADP(H)的转换及NADPH的供应有关,我们测定了pos5A的胞内辅酶(NAD+/NADH/NADP+/NADPH)含量,结果证实,Pos5p对胞内NADPH的供应有着重要作用,而在VK3、H2O2和DEM胁迫下,Pos5p通过发挥其NADH激酶活性,有效地完成NAD(H)向NADP(H)的转换,补充细胞在氧化胁迫下所消耗的NADP(H),表明Pos5p以其NADH激酶活性在细胞抵抗氧化胁迫中起到保护作用。
　　 最后我们分析了pos5△在正常条件和氧化胁迫条件下的呼吸链酶复合体(复合体Ⅱ、复合体Ⅲ、复合体Ⅱ+Ⅲ和复合体Ⅳ)活性。结果发现,POS5的缺失导致复合体Ⅱ和复合体Ⅳ的活性明显低于野生型菌株,说明pos5△的呼吸功能确实存在一些缺陷;在H2O2和DEM胁迫下,pos5△的酶复合体活性多数都有不同程度下降,而在VK3胁迫下,酶复合体活性则有不同程度上升,其中可能的适应性反应机制还有待深入研究。
　　 酿酒酵母既是一种重要的工业应用微生物,也是一种典型的模式真核微生物。本课题对酿酒酵母NADH激酶Pos5p在抵抗氧化胁迫中的作用做了以上几方面的研究,证明了Pos5p对细胞抗氧化系统及抵抗不同类型的氧化胁迫都有重要的作用,这将有助于我们全面了解酿酒酵母的抗氧化机制,为更好地改进其抗氧化性能奠定了基础。

目录

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第一章 引言

1.1 酿酒酵母NADH激酶

1.1.1 NAD(H)和NAD(P)H的供应及功能

1.1.2 pos5△的氧化胁迫敏感

1.1.3 pos5△的呼吸缺陷

1.1.4 pos5△的精氨基酸合成缺陷

1.2 氧化胁迫与抗氧化防御体系

1.2.1 氧化胁迫与活性氧

1.2.2 抗氧化防御体系

1.3 电子传递链

1.4 立题背景与意义

1.5 课题研究内容

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株、质粒和引物

2.1.2 培养基

2.1.3 酶和主要试剂

2.1.4 酿酒酵母醋酸锂转化法所用试剂

2.1.5 酿酒酵母基因组提取试剂

2.1.6 酿酒酵母线粒体制备试剂

2.1.7 呼吸链酶复合体活性测定试剂

2.1.8 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的培养及生长表型

2.2.2 质粒的提取和验证

2.2.3 敲除片段PCR扩增及纯化

2.2.4 酿酒酵母醋酸锂转化法

2.2.5 酿酒酵母基因组的提取

2.2.6 酿酒酵母敲除体的验证

2.2.7 细胞内活性氧水平的测定

2.2.8 细胞内辅酶含量的测定

2.2.9 酿酒酵母线粒体的制备

2.2.10 呼吸链酶复合体活性测定

第三章 结果与讨论

3.1 POS5△的氧化胁迫表型

3.1.1 pos5△与抗氧化基因单缺失体的氧化胁迫表型

3.1.2 抗氧化基因双缺失体sod2glr1△和trr2glr1△的构建及验证

3.1.3 pos5△与抗氧化基因双缺失体的氧化胁迫表型

3.1.4 阶段小结

3.2 POS5△的细胞内活性氧水平

3.2.1 pos5△的胞内活性氧浓度

3.2.2 阶段小结

3.3 POS4△的细胞内辅酶含量

3.3.1 标样的分离

3.3.2 正常环境下pos5△等突变菌株的胞内辅酶含量

3.3.3 甲萘醌(VK3)胁迫下pos5△的胞内辅酶含量

3.3.4 过氧化氢(H2O2)胁迫下pos5△的胞内辅酶含量

3.3.5 马来酸二乙酯(DEM)胁迫下pos5△的胞内辅酶含量

3.3.6 SD中期与末期细胞内辅酶Ⅱ/Ⅰ比较

3.3.7 阶段小结

3.4 POS5△的线粒体呼吸链酶复合体活性

3.4.1 pos5△的呼吸链酶复合体活性

3.4.2 阶段小结

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文