酿酒酵母菌和白念珠菌中RCK2和HOG1蛋白激酶在高渗胁迫，氧化胁迫和细胞壁完整性方面的功能研究

摘要

酿酒酵母ScRck2p是一种MAP Knase激活的蛋白激酶，被Hoglp磷酸化而激活，响应于细胞对外界高渗透压胁迫和氧化胁迫。在本工作中我们发现酿酒酵母ScRCK2基因的缺失能够导致细胞对TOR抑制剂——雷帕霉素敏感，但ScRCK2在细胞对雷帕霉素敏感过程中的作用并不依赖于其激酶活性。在人体内最常见的机会致病菌-白念珠菌中，我们鉴定了ScRCK2的同源基因CaRCK2,并发现CaRCK2基因的缺失同样导致白念珠菌细胞对雷帕霉素敏感，CaRck2p的这一作用同样不依赖于其激酶活性。此外，我们发现白念珠菌CaHOG1的缺失也导致细胞对雷帕霉素的敏感。这些结果表明在酿酒酵母菌和白念珠菌中，作用于HOG途径下游的RCK2可能调控TOR信号途径的功能。
　　 同时，我们发现白念珠菌CaRCK2基因的缺失能够导致细胞对高渗胁迫、氧化胁迫和细胞壁完整性胁迫试剂敏感。比较而言，酿酒酵母ScRCK2基因的缺失只引起细胞对氧化胁迫敏感，而不影响细胞对高渗胁迫和细胞壁完整性胁迫试剂的敏感。但是，酿酒酵母ScRCK2基因却能够弥补白念珠菌CaRCK2基因缺失株对高渗胁迫、氧化胁迫和细胞壁完整性胁迫试剂的敏感性表型。这些结果说明RCK2在细胞内发挥多种功能，但在白念珠菌和酿酒酵母菌中的功能存在分歧。
　　 我们还发现，ScRCK2上游激酶基因ScHOG1和ScPBS2的缺失，以及受ScHOG1调控的转录因子基因ScHOT1，ScMSN1，ScMSN2，ScMSN4或ScRLM1的缺失，不影响酵母细胞对雷帕霉素的敏感性。但是，白念珠菌CaHOG1基因的缺失能够导致细胞对雷帕霉素敏感。这些结果表明白念珠菌HOG途径与酿酒酵母HOG途径在细胞功能调控方面存在分歧，它参与细胞对雷帕霉素敏感性的调控。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1酿酒酵母和白念珠菌HOG MAPK信号转导途径简介

1.1.1酿酒酵母HOG信号转导途径的组成及调控

1.1.2白念珠菌HOG途径与酿酒酵母HOG途径的差异

1.2酿酒酵母HOR途径简介

1.2.1 TOR复合物的组成

1.2.2 TOR对细胞生长的调控

1.2.3 TOR对蛋白质合成和稳定性的调控

1.2.4 TOR对转录的调控

1.3酿酒酵母ScRCK2基因研究进展

1.4本论文的研究内容与意义

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种

2.1.2质粒

2.1.3主要实验仪器

2.1.4培养基

2.1.5试剂

2.1.6常用溶液与缓冲液

2.2实验方法

2.2.1大肠杆菌和酵母菌的培养与菌种保存

2.2.2 CaCl2法制备感受态细胞

2.2.3质粒转化E.coli感受态细胞

2.2.4 SDS碱裂解法小量制备质粒DNA

2.2.5 SDS碱裂解法大量制备质粒DNA

2.2.6玻璃珠法提取酵母基因组DNA

2.2.7液氮法提取酵母基因组DNA

2.2.8 PCR扩增DNA片断

2.2.9乙醇沉淀法纯化DNA片断

2.2.10 DNA片断的柱纯化

2.2.11酶切

2.2.12连接

2.2.13 α互补筛选阳性克隆实验

2.2.14乙酸锂法转化酿酒酵母细胞

2.2.15乙酸锂法转化白念珠菌细胞

2.2.16梯度连续稀释实验

2.2.17网络共享资源简介

第三章 ScRCK2基因在细胞对雷帕霉素敏感性中的作用

3.1酿酒酵母ScRCK2基因的缺失导致细胞对雷帕霉素敏感

3.2 ScRCK2突变体在酿酒酵母细胞对雷帕霉素敏感性中的作用

3.3小结与讨论

第四章白念珠菌CaRCK2基因的克隆与鉴定

4.1白念珠菌CaRCK2基因的克隆与激酶缺陷突变体CaRCK2KD的构建

4.1.1白念珠菌CaRCK2基因的生物信息学分析

4.1.2白念珠菌CaRCK2基因的克隆

4.1.3白念珠菌CaRCK2基因激酶缺陷突变体CaRCK2KD的构建

4.1.4质粒pCR4-CaRCK2和pCR4-CaRCK2KD的构建

4.2白念珠菌CaRCK2基因可以互补酿酒酵母ScRCK2基因的功能

4.3过量表达CaRCK2和CaRCK2KD对酿酒酵母rck2△抗氧化胁迫能力的影响

4.4小结与讨论

第五章白念珠菌CaRCK2基因的敲除与功能研究

5.1 CaRCK2基因敲除盒的构建

5.2白念珠菌CaRCK2基因的敲除

5.3 CaRCK2基因缺失株的功能研究

5.3.1 CaRCK2基因的缺失导致白念珠菌细胞生长缓慢

5.3.2 CaRCK2基因的缺失导致白念珠菌细胞对雷帕霉素敏感

5.3.3 CaRCK2基因与白念珠菌细胞对氧化胁迫反应有关

5.3.4 CaRCK2基因的缺失导致白念珠菌细胞对高渗胁迫敏感

5.3.5 CaRCK2基因的缺失导致白念珠菌细胞对LiCl敏感

5.3.6 CaRCK2基因的缺失导致白念珠菌细胞对SDS，CFW和CongoRed敏感

5.4酿酒酵母ScRCK2对白念珠菌CaRCK2的功能互补情况

5.4.1酿酒酵母ScRCK2基因和激酶缺陷突变体ScRCK2KD的亚克隆

5.4.2酿酒酵母ScRCK2基因对白念珠菌CaRCK2基因的功能互补

5.5小结与讨论

第六章酿酒酵母和白念珠菌HOG途径在雷帕霉素敏感性中的作用

6.1酿酒酵母HOG途径与细胞雷帕霉素敏感性之间的关系

6.2白念珠菌HOG途径与细胞雷帕霉素敏感性之间的关系

6.3白念珠菌CaHOG1基因缺失株新表型的发现

6.4小结与讨论

参考文献

发表论文和科研情况说明

致 谢