中药材（石斛）鉴定特异性gDNA探针的筛选与应用研究

摘要

本文以名贵中药材石斛为研究材料，首先创立了一种在全基因组范围筛选种特异性探针的“SSH-array”新技术，成功筛选到了一定数量的不同石斛种特异性探针。其次，建立了多重种特异性探针物种鉴定的“MSSP”新方法，对石斛样本进行了准确鉴定。在“SSHarray”技术的基础上，创立了应用于基因组DNA(gDNA)遗传多态性研究的“DiversitySSH-array”新方法，有效地对6种石斛品种遗传多态性进行了研究并以此建立了6种石斛的遗传亲源树状图。此外，以我们获得的种特异性探针为基础，设计和筛选到两个种特异性引物，为以PCR方法进行物种鉴定提供了新的途径。 本文所获得的主要研究成果如下： 1.筛选gDNA种特异性探针的“SSH-array”新技术该方法是将抑制性差减杂交与基于尼龙膜微阵列杂交相结合。首先是用抑制性差减杂交获得两个品种之间的gDNA差异片段，然后用这些gDNA差异片段与由所有研究品种的gDNA制备成的微阵列杂交筛选到某一个品种的种特异性gDNA片段。这些种特异性gDNA片段可以作为种特异性探针进行物种鉴定。在该研究中，以迭鞘石斛(D.aurantiacumKerr)，金钗石斛(D.nobileLind.)，铁皮石斛(D.officinaleKimuraetMigo)，鼓槌石斛(D.chrysotoxumLindl.).流苏(D.fimbriatumHook.)为材料，对该方法的可行性进行了研究。结果显示：五种石斛的阳性克隆率最低78.1％，最高84.6％，阳性克隆率平均达到82.3％，五种石斛种质特异性探针的阳性探针筛选率最低7.9％，最高14.6％，平均达到12.1％，初步获得了25个种特异性探针。结果表明该方法能够有效地进行gDNA种质特异性探针筛选。 2.多重种质特异性探针(multiplespecies-specificgDNAprobes，MSSP)的石斛鉴定用“SSH-array”方法从5种石斛中筛选到的14个种质特异性探针点样制备成微阵列，地高辛标记的不同的商品石斛样本和伪品的gDNA与该微阵列杂交成功地对五种常见的石斛品种其中包括《中国药典》收录的三种石斛进行了鉴定。对这些特异性探针的序列结构、有效性及特征进行了研究。结果显示出多重种质特异性探针能够准确地鉴别不同的商品石斛样本、混合材料中的靶样本及伪品。。 3.研究遗传多态性的“DiversitySSH-array”新方法基因组DNA的多态性在研究不同物种间的生物多样性和遗传特征追踪等方面具有非常重要的意义。“DiversitySSH-array”技术首先通过抑制性差减杂交获得随机配对的两个品种之间的差减片段，差减片段进行克隆后，用这些差减克隆建立差减gDNA文库。从差减gDNA文库中随机挑选差减克隆制备多样性差减微阵列(DiversitySSH-array)。DiverstySSH-array与DIG标记的待分析样本的gDNA杂交获得DNA多态性图谱。六个石斛品种作为该项研究的材料，其中的四个品种作为Tester进行抑制性差减杂交，共获得617个阳性差减克隆，平均阳性克隆率80.3％。四个品种两两比较的平均多态片段率高达42.4％，依据六个品种的多态图谱建立了遗传亲源树状图。结果表明DiversitySSHarray为研究不同样本gDNA多态性及遗传距离提供了一个低成本、有效的分析技术平台。 4.石斛种特异性引物的筛选 我们以“SSH-array”方法从5种石斛中筛选到的10个种质特异性探针序列为基础，设计了10对引物。其中的两对引物能够从它们所代表的样本中扩增出单一条带而不能从其它四个品种样本和石仙桃中扩增出条带。一对为流苏石斛的种特异性引物，另一对为鼓槌石斛的种特异性引物。这两个引物能够分别从其它四个品种和石仙桃中鉴别出流苏石斛或鼓槌石斛。结果显示该方法是方便可行的。

目录

文摘

英文文摘

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第一章绪论

1.1中药品种鉴定在中药质量控制中的地位与发展

1.1.1中药品种的现状

1.1.2中药品种鉴定是中药质量控制的首要环节

1.1.3中药品种分类鉴定依据及方法的发展

1.1.4研究范围从物种间深入到物种内

1.1.5研究手段不断推陈出新

1.1.6研究思路呈现出多元化的发展

1.2中药鉴定的主要方法及其发展

1.2.1基原鉴定法

1.2.2性状鉴定法

1.2.3显微鉴定法

1.2.4理化鉴定法

1.2.5生物鉴定法

1.2.6存在的问题与发展方向

1.3本课题的主要目标及研究内容

参考文献

第二章实验材料与技术路线

2.1实验材料概述

2.1.1石斛的药用价值与分类

2.1.2中药石斛鉴定的意义

2.1.3石斛的鉴定现状

2.1.4临床应用

2.2中药鉴定gDNA芯片主要技术路线

2.2.1种质特异性探针的筛选

2.2.2种质特异性探针制备DNA芯片(DNA微阵列)

2.2.3待鉴样品DNA的提取、扩增及标记

2.2.4检测样品DNA与芯片杂交

2.2.5结果检测与分析

附图

参考文献

第三章特异性探针的筛选-“SSH-array”技术

3.1抑制性差减杂交

3.1.1 SSH技术的基本原理

3.1.2主要过程

3.2试验材料与研究方法

3.2.1试验材料和仪器

3.2.2基因组DNA的提取与检测

3.2.3 gDNA的酶切

3.2.4接头、引物的设计与接头连接

3.2.5抑制性差减杂交

3.2.6差减产物的PCR扩增

3.2.7 PCR产物的胶回收柱子纯化

3.2.8差减PCR产物的克隆

3.2.9差异克隆的扩增与标记

3.2.10用于筛选探针的gDNA微阵列的制备

3.2.u DIG标记的差减克隆与gDNA微阵列的杂交筛选

3.3实验结果与讨论

3.3.1石斛DNA的检测

3.3.2 Rsa I酶切效果

3.3.3差减杂交及PCR扩增产物检测

3.3.4差减PCR产物的有效纯化

3.3.5差减杂交PCR产物的克隆及阳性克隆率

3.3.6探针特异性与筛选效率分析

3.3.7特异性探针的物种鉴定的有效性

3.3.8特异性探针杂交图象与序列分析

参考文献

第四章多重探针的物种鉴定研究-“MSSP”技术

4.1材料与方法

4.1.1试验材料和仪器

4.1.2主要试剂

4.1.3用于多重探针试验标准样品的准备

4.1.4试验样品的DNA提取与检测

4.1.5 gDNA的酶切与接头连接

4.1.6多重探针(multiple species-specific gDNA probes，MSSP)DNA阵列的制备

4.1.7 DIG标记的gDNA和DNA阵列的杂交

4.1.8杂交结果的检测和分析

4.2实验结果与讨论

4.2.1多重探针的序列分析

4.2.2试验样本gDNA酶切与标记效果

4.2.3杂交温度的优化分析

4.2.4多重探针物种鉴定的准确性

参考文献

第五章基因组遗传多态性研究“Diversity SSH-array”技术

5.1材料与方法

5.1.1实验材料

5.1.2样本gDNA提取与纯化

5.1.3 SSH及差减片段的克隆

5.1.4差减片段的扩增

5.1.5多样性微阵列的制备

5.1.6样本gDNA的地高辛(DIG)标记

5.1.7 DIG标记gDNA与多样性微阵列的杂交

5.1.8杂交结果的检测与分析

5.2结果与讨论

参考文献

第六章特异性引物的筛选与扩增

6.1材料与方法

6.1.1实验材料

6.1.2试剂与仪器

6.1.3样本DNA的提取

6.1.4引物的设计

6.1.5 PCR的扩增与产物的纯化

6.2结果与讨论

附录：实验试剂及配方

博士研究生期间发表的主要论文

博士研究生期间主要申请专利

博士研究生期间承担的主要研究课题

博士研究生期间GenBank收入的基因组核酸序列

致谢