抗PEG10单克隆抗体的制备及在肝癌中的初步应用

摘要

长期以来，肝癌发病率高，恶性度高，死亡率高。早期发现、早期治疗是提高患者生存率的关键。甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein，AFP）是当前临床上判断原发性肝细胞肿瘤（Hepatic Cell Carcinoma HCC）的重要标志物，已经被广泛应用，但容易造成相当数量的误诊和漏诊。所以开发更新、更特异、更敏感的肝癌分子标志物成为当前非常紧迫的课题。近年有研究表明父系表达基因PEG10（paternally expressed gene10，PEG10）与HCC的发生和发展密切相关，且在肝癌组织中的表达敏感性与AFP接近，但比AFP具有更高的肝癌组织特异性。因此PEG10基因很可能成为一种新的分子标志物，在肝癌的诊断、个体化治疗及预后判断等方面发挥重要作用。目前，该分子表达与肿瘤发生发展的关系等还有待进一步深入研究。因此，制备高特异性抗PEG10单克隆抗体有重要意义。本实验小组通过合成PEG10抗原多肽，偶联KLH，免疫Balb/c雌鼠，采用杂交瘤技术制备单克降抗体（McAb），采用离子交换层析对小鼠IgG腹水进行了纯化，获得两个纯化的抗体，分别命名为3E8和3F3。在此基础上，以细胞系HepG2，HepG2.215，MHCC-97L，BEL-7404，SMMC-7721，L02，HO8910，EC9706为受试细胞，考察各细胞系中PEG10的表达情况，并进一步探讨在15对肝癌和邻近癌旁组织的表达情况，以及不同分级的肝癌组织中的表达情况，为该基因的临床应用提供基础。
　　 目的：
　　 1、PEG10-RF1抗原表位进行预测，合成相应肽段，将其与合适载体偶联，制备PEG10单克降抗体（McAb）。
　　 2、PEG10单克降抗体（McAb）进行特性鉴定及McAb的纯化。
　　 3、纯化的抗体进行临床上的初步应用。
　　 方法：
　　 1、采用Antigen Design Tool软件分析PEG蛋白的空间结构，计算得出优势抗原表位，通过高效液相色谱（HPLC）分析法和电喷雾质谱（ESI-MS）分析法对合成出来的抗原进行鉴定。
　　 2、通过细胞融合技术，以PEG10抗原免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。通过多次阳性筛选和有限稀释，建立了抗人PEG10单克隆抗体杂交瘤细胞株。
　　 3、采用离子交换层析对小鼠IgG腹水进行了纯化，利用SDS-PAGE电泳、间接ELISA法、Western blot方法、免疫组织化学方法对单克降抗体的特性进行鉴定。
　　 4、采用Western blot方法检测不同细胞系中PEG10表达情况。
　　 5、采用免疫组织化学方法检测不同分级肝癌组织、癌旁组织中PEG10表达情况。
　　 结果：
　　 1、成功获得PEG10-RF1抗原多肽，并与KLH相偶联。合成多肽经高效液相色谱分析为单一峰，纯度达到85％以上，电喷雾质谱分析显示分子量的测定值符合理论值，经鉴定符合要求。
　　 2、杂交瘤细胞株的建立融合率达95％，阳性率为15％，最终获得两株稳定分泌抗PEG10抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3E8和3F3。
　　 3、制备并纯化了两株（3E8和3F3）抗PEG10单克隆抗体，经鉴定该两株抗PEG10单克降抗体的Ig亚类均为IgG1。纯化后的两株单克降抗体经SDS-PAGE电泳，根据BD凝胶成像系统里的Quantity one软件计算，所制备抗体纯度达85％以上。用间接ELISA方法测定PEG10单抗均不与无关抗原结合反应，表明特异性好。按照SouthernBiotech试剂盒说明书对阳性杂交瘤培养上清液进行检测，结果显示两株细胞分泌的单抗均为IgG1类，轻链均为κ链。Western blot实验结果表明，制备出的3E8株单抗能和天然PEG10蛋白发生特异性反应，而3F3株单抗不能与天然PEG10蛋白发生特异性反应。免疫组织化学实验结果显示两株抗PEG10单克隆抗体与肝细胞肝癌组织反应后均能，生成棕色或棕褐色沉淀，主要位于肝癌细胞的胞质。
　　 4、Western Blot实验结果表明，五株肝癌细胞系PEG10蛋白均有较强的表达，而正常肝细胞系L02和卵巢癌细胞系HO8910、食管癌细胞系EC9706均不表达。PEG10蛋白。
　　 5、免疫组织化学实验结果显示，同一病例的肝癌组织高表达PEG10蛋白，而相应的邻近癌旁组织低表达或不表达PEG10蛋白。在不同分级的肝癌组织中，PEG10蛋白的表达量是不同的，肝癌组织恶性程度越高，PEG10蛋白的表达量也越高。
　　 结论：
　　 1、得到两株特异性较好的抗PEG10单克隆抗体，均为IgG1类，轻链均为κ链，分别命名为3E8和3F3。
　　 2、PEG10在已检测的肝癌组织及肝癌细胞系中高表达，而在正常肝组织和肝细胞中以及其它器官的肿瘤细胞株均不表达，提示PEG10具有高度组织特异性。
　　 3、PEG10在已检测的不同分化程度的肝癌组织中表达量不同，且恶性程度越高，PEG10表达量越高；恶性程度越低，PEG10表达量越低，提示PEG10表达量与恶性程度具有一定的正相关性。

目录

文摘

英文文摘

符号、变量、缩略词等本论文的专用术语注释表

前言

综述

参考文献

第一部分 抗PEG10单克隆抗体的制备和鉴定

一、材料与方法

1 材料

2 实验方法

二、结果

三、讨论

四、结论

第二部分 抗PEG10单克隆抗体在肝癌中的初步应用

一、材料与方法

1.材料

2.主要实验方法、原理及步骤

二、结果

三、讨论

四、结论

小结与展望

参考文献

致谢

作者简介