滚环扩增技术在DNA甲基化检测芯片及高通量DNA测序技术中的应用研究

摘要

DNA芯片是通过将大量不同的DNA靶分子按照已知顺序固定在固相基片（多数采用玻片）上组成密集的微阵列（Microarray）或阵列(Array)，利用核酸杂交原理对靶核酸进行检测分析。滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)是一种恒温扩增技术，在DNA、RNA、SNP、细胞原位检测、全基因组扩增方面有较多的应用。异常的DNA甲基化与癌症及许多其他疾病的发生密切相关，发展高通量和高特异性的DNA甲基化检测芯片具有重要的临床应用价值。本论文以滚环扩增技术为主，发展了多种基因组DNA甲基化检测的新的DNA芯片检测方法。本论文还针对新一代DNA测序技术中的高密度DNA文库制备问题，采用滚环扩增技术和在片原位链替代方法获得了可用于测序的基因组片段芯片。还进一步地把高密度磁珠微阵列技术和微流体芯片技术相结合，发展了一种高密度磁珠的微流体DNA测序芯片。
　　 具体内容包括：
　　 1、基于分枝滚环扩增(HRCA)技术的特定CpG位点的甲基化检测芯片。
　　 针对包含酶切位点的特定CpG位点，提出并实现了一套新的基于分枝滚环扩增原理的样本处理方案。设计一个锁式探针与目标DNA序列在CpG位点杂交，并通过甲基化敏感性内切酶和连结酶对锁式探针与目标DNA同时进行酶切和连结。当CpG位点处于甲基化状态，锁式探针能成功地被连接酶环化，成为HRCA反应的环状模板。连结形成的环状模板与HRCA反应所需的两个引物杂交后启动HRCA扩增。将一个引物末端进行丙烯酰胺修饰，可以使HRCA产物固定在丙烯酰胺基片上形成3-维胶基DNA微阵列。通过与CY3标记的探针杂交，即可检测CpG位点的甲基化状态。利用这个方法，我们成功地对位于P15，E-cadherin，hMLHl和MGMT基因上的四个CpG位点的甲基化状态进行分析。实验结果得到甲基化特异性PCR验证。研究表明，该方法快速便捷，可用于高通量定性分析基因组DNA中特定CpG位点的甲基化。
　　 2、基于滚环扩增(RCA)技术的CpG岛甲基化的定量检测芯片。
　　 为了识别目的基因中的甲基化和未甲基化的CpG位点，样品DNA首先用亚硫酸氢盐处理。目标区域通过PCR扩增后，未甲基化的CpG二核苷转化成TpG；同时甲基化的CpG得到保留。设计一对锁式探针，其中一条与CpG位点匹配，另一条与TpG匹配。锁式探针对与纯化的PCR产物杂交，当锁式探针的两个末端与PCR产物匹配时，锁式探针才能被连结，并形成RCA反应所需的环状模版。这样，通过我们设计的一对锁式探针，把原目标基因中CpG位点甲基化状态的信息用对应的环状模版所表述出来，并在下一步的RCA反应中被放大。连结的锁式探针与RCA通用引物杂交后，在Φ29DNA聚合酶作用下，通过RCA反应进行扩增。RCA产物固定在玻片上形成DNA微阵列。DNA微阵列与通用的CY3-CY5双色探针对进行杂交。而这两种通用探针分别针对甲基化和非甲基化而设计的，通过杂交产生的两种荧光强度的比值可以用来检测样本中的甲基化状态。利用这个方法，我们成功地对位于P16和IGFBP7基因上的CpG岛的甲基化状态进行了定量分析，实验结果得到甲基化特异性PCR验证。实验结果表明，这种RCA产物微阵列有望用于CpG岛的甲基化状态的定量分析。
　　 3、利用滚环扩增和在片原位链替代扩增来平行展示基因组片段。
　　 高通量测序技术，要求在一个芯片大小的面积上，同时进行上百万个大规模平行的测序反应以获得极高的测序通量。因此只有将上百万个待测基因组DNA片段平行地展示于芯片，形成高密度的DNA测序芯片，才能满足这种高通量测序的要求。我们利用Φ29 DNA聚合酶进行两步扩增从而在玻片上产生大量的DNA克隆群落，这些克隆群落可以实现基因组DNA片段在玻片上的平行展示。本研究中，在φ29 DNA聚合酶作用下，基因组DNA片段先以RCA的方式在液相中扩增，然后再以链替代反应的方式在玻片上进一步扩增。利用这个方法产生的DNA克隆群落成功地实现了T7基因组片段在玻片上的平行展示。这些DNA克隆群落可以成功地用杂交或荧光-dNTP进行识别，被展示的DNA片段和背景荧光信号有明显的区别。本方案有较好的重现性，用本方案产生的DNA克隆群落有望用于高通量测序。
　　 4、利用微流体技术和磁珠阵列制作高密度测序芯片。
　　 通过磁珠乳液PCR可以制备出表面带大量DNA片段克隆的磁珠，这种克隆磁珠已经成功用于制备高密度测序芯片。但现行方案制备的磁珠测序芯片用于高通量测序时，在测序过程中对试剂的消耗量非常大。我们设计了微流体芯片，并将带有DNA片段克隆的磁珠以共价结合的方式，固定于微流道中形成高密度测序芯片。这种芯片经本实验室开发的AG-100测序仪检验，可以用于高通量测序，而相同的测序通量的情况下，试剂的消耗量减少了一个数量级，可大幅度降低测序成本。