基于高通量测序技术的核酸文库制备新方法及对孕妇miRNA表达谱的研究

摘要

MicroRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的小分子非编码RNA，广泛存在于真核生物中，参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列的重要生物学过程，具有重要的生物学功能。游离核酸是一种存在于生物体体液中且处于细胞外游离状态的核酸，包括所有种类的核酸，其主要存在于血浆、血清、尿液、唾液、羊水、精液、前列腺液等各种体液。近年来，游离miRNA的研究成为一大热点，主要集中于癌症、胎儿及妊娠相关疾病的诊断应用。先兆子痫(pre-eclampsia，PE)是一种妊娠特有疾病，表现为孕妇高血压、蛋白尿等，全球发病率高达3％-5％，且发病机制较为复杂。有研究发现子痫与miRNA的表达相关。高通量测序技术具有测序速度快、成本低、通量高等优点，广泛应用于miRNA研究。但目前而言，高通量测序技术中测序文库制备过程步骤繁琐，耗时长，花费高。特别是在文库制备过程中需通过割胶方法来选择出合适长度的模板，以及采用PCR扩增低丰度的目标片段序列，有可能会影响测序结果的真实性。因此，改进测序文库制备方法，使其能够真实反映样本中的原始信息，是研究者们追求的重要目标之一。
　　本论文针对目前测序文库制备过程中存在的问题，改进了测序文库制备的方法。并利用上述改进的方法，制备出相应的测序文库。本论文采用三种类型的样本(包括母体血清、脐带血血清及胎盘)，对先兆子痫和正常孕妇的两类miRNA(胞外游离miRNA和细胞内miRNA)进行高通量测序分析。此外，结合高通量测序数据及miRNA的生物学功能开展数据挖掘研究。利用测序数据的高灵敏度及高通量特点，针对多重的miRNA变体(miRNAisoforms，isomiRs)，研究其isomiR分布谱及表达模式。
　　主要研究内容和成果如下：
　　1.基于高通量测序技术的测序文库制备新方法研究
　　针对目前高通量测序的文库制备过程存在的问题，如过程繁琐、费用较高、对初始样本量要求较高等，本论文中研究了三种新的文库制备方法。
　　1)基于SOLiD测序文库制备的改进研究
　　针对SOLiD文库制备方法中存在的问题，对其片段化条件、接头连接条件、乳液PCR条件等进行了研究，提出了分步连接的接头连接方法，不仅有效地降低费用，同时也提高文库质量，并通过对测序结果的分析，显示该方法将接头自连比率由原有SOLiD中的59.19％降至27.33％，有效地提高了测序的通量。
　　2)基于固体介质的连接产物制备新方法研究
　　该方法利用固体介质为载体，通过分步连接法将待测序的核酸片段与一对测序接头进行连接。即采用若干条上游测序接头固定在介质上并与待测序核酸连接，再把下游测序接头连接在待测序核酸的另一端，其后将连接的测序模板释放到溶液中，最后采用常规的乳液PCR方法制备测序文库。该方法省去了传统测序文库制备方法中液相连接和割胶纯化过程。具有操作简捷、损耗低、费用低、产物纯度高、反应效率高、对初始样本量要求低等优点，且该方法制备的连接产物可应用于多种高通量测序平台。
　　3)基于固体介质的测序文库制备新方法研究
　　该方法利用固体介质为载体，通过分步连接法将一条待测序的核酸片段连接在固体介质上，然后直接进行乳液PCR扩增制备测序文库。即在介质上仅固定一条测序接头和若干测序引物序列，以便在介质表面直接连接以及PCR扩增。该方法具有操作简捷、文库制备效率高、费用较低等，可以不仅有效地简化常规文库制备中对样本核酸PCR、割胶纯化等繁琐过程，还有助于提高文库制备的质量、提高文库的灵敏性和保真性，并为文库制备的自动化提供可能。
　　2.基于高通量测序技术的子痫样本中miRNA表达谱分析
　　本论文中研究17例样本中miRNA的表达谱，样本来源于五位孕妇，包括2位重度先兆子痫孕妇、2位轻度先兆子痫孕妇及1位正常孕妇，其中针对先兆子痫孕妇，分别留取了胎盘、母体血清及脐带血血清样本；针对正常孕妇，留取了胎盘、母体血清、脐带血血清、母体血细胞及脐带血血细胞。
　　首先比较、研究了三种miRNA提取方法，包括Trizol-酚氯仿法、蛋白酶K-酚氯仿法及mirVanaIsolationKit法，通过对提取结果进行质量分析，发现mirVanaIsolationKit法提取效率较高，产物质量较好。基于SOLiD测序仪，对17例先兆子痫及正常孕妇样本中的miRNA表达谱进行研究，通过生物信息学的方法，得到并比较研究了各样本中miRNA表达谱。主要研究结果如下：
　　1)miRNA表达谱与先兆子痫的相关性
　　本论文首次对先兆子痫孕妇三种样本中的miRNA表达谱进行高通量测序分析，寻找与先兆子痫表达相关的miRNA。在胎盘、母体血清和脐带血血清等三类样本中均发现多个与先兆子痫表达相关的miRNA。以正常孕妇样本为对照，在胎盘样本中发现了11种miRNAs，其中10种下调、1种上调；母体血清样本中发现了22种miRNAs，其中7种下调、15种上调；脐带血血清样本中发现了8种miRNAs，其中6种下调、2种上调。对上述表达相关的miRNAs进行了深度生物信息学分析，发现其与先兆子痫疾病相关，提示血清中游离miRNA可作为先兆子痫疾病标记物。
　　2)miRNA表达谱在血清样本与胎盘样本中的相关性
　　本论文首次对孕妇的胎盘、母体血清、脐带血血清等三类样本的miRNA进行高通量测序分析，并对其miRNA表达谱进行比较研究。研究发现，51种miRNAs在三类样本中共表达，且其中6种miRNAs表达水平相似；2种miRNAs血清中表达水平高于胎盘；13种miRNAs在胎盘与母体血清中共同表达；12种miRNAs在胎盘与脐带血血清中共同表达，且hsa-miR-150、hsa-miR-15a、及hsa-miR-25在脐带血血清中表达水平高于胎盘，而hsa-miR-532-5p表达在两者间相似；1种miRNA(hsa-miR-1975)在母体血清和脐带血血清间共表达。该研究发现，三类样本中的miRNA表达谱具有高度相关性，说明母体及胎儿脐带血清中游离miRNA可能来源于胎盘组织。
　　3)miRNA表达谱于细胞内外以及孕妇与胎儿间的相关性分析
　　本论文首次对孕妇的胎盘、母体血清、母血血细胞、脐带血血清及脐带血血细胞五类样本系统地进行miRNA表达谱的高通量测序分析，并对五类样本中miRNA表达谱进行比较研究。研究发现，120种miRNAs在五类样本中共表达，且每类样本中表达水平前50位的miRNA几乎均包括其中；通过对表达谱的差异分析发现，两类血清样本间游离miRNA表达谱较为相似；两类血清中游离miRNA表达谱与其相应地血细胞内的miRNA表达谱差异较显著；胎盘中的miRNA表达谱与两类血清样本的miRNA表达谱亦差异显著：同时针对那些已报道的与妊娠表达相关的miRNA研究发现，其在胎盘样本中均特异表达或具有较高的表达水平。研究表明，胞外游离miRNA与细胞内miRNA以及胎盘与血清样本间miRNA表达谱存在一定的相关性。
　　4)miRNA/isomiR分布谱及表达模式分析
　　本论文充分利用高通量测序技术所得到的miRNA信息的多样性和灵敏性，针对所有样本中的miRNA异构体(miRNAisoform，isomiR)进行分析。研究结果显示：isomiR与miRBase中的成熟miRNA参考序列相比，其在序列3’端的差异较5’端更为频繁，而对于碱基的添加和缺失则概率相当；在所有的测序结果中，40％为非异构体(与miRBase中参考序列相同，即具有0个碱基差异的isomiR)、40％为具有1个碱基差异的isomiR、15％为具有2个碱基差异的isomiR、其它共占5％的则为具有3个及3个以上碱基差异的isomiR；且以上特征与具体miRNA的表达水平、胞内或胞外、是否为疾病等并无特定关系。研究发现，isomiR并非先前所认为的由miRNA生成过程中Drosha和Dicer酶等不规则剪切而来，而是其优势加工位点集中在pre-miRNA中的连续的1-3个碱基。
　　上述研究既寻找出母体血清、脐血血清、胎盘中可能与先兆子痫表达相关的miRNA，提供了先兆子痫诊断的可能的标记物；同时，发现母体血清中游离miRNA表达谱不仅包含有孕妇自身的信息，同时也包含了胎儿的信息，为将母血血清中游离miRNA作为胎儿产前无创性检测标记物提供有力的理论支持；其次，通过表达谱的比较分析，发现游离miRNA可能来源于某些细胞的选择性主动释放；进一步可推测，在妊娠期中母亲与胎儿不只是营养物质的交流，也有核酸信息的交流。