基于静电纺丝技术的可降解支架基础研究

摘要

静电纺丝纤维具有高比表面积、高孔隙率和孔尺寸小等类似天然细胞外基质的结构，在过滤、伤口敷料以及三维组织工程支架等方面具有许多潜在的用途。本论文采用静电纺丝技术分别制备了混纺、核-壳结构的载药微纳米纤维支架，并基于两性离子聚合物优良的抗蛋白质性能对纤维支架进行表面改性，以期得到从成分和结构上类似天然细胞外基质，且具有相应的力学性能、生物功能和良好生物相容性的组织工程支架。本研究主要分为以下四个部分：
　　(1)结合壳聚糖(CS)良好生物相容性和聚已内酯(PCL)优越的力学性能，通过混合静电纺丝的方法制备了CS/PCL纤维支架。通过调节静电纺丝过程中的各个参数，可得到直径分布均匀、表面光滑的CS/PCL纤维，纤维平均直径在400nm左右；力学性能测试表明该纤维支架的力学性能与两组分的所占比例相关。当CS与PCL的质量比为0.5时，静电纺丝所制备CS/PCL血管支架的弹性最大形变达到31.64％，应力-应变曲线显示其弹性变形能力较强；复合共培养内皮祖细胞(EPCs)测定细胞在血管支架膜上的黏附率和荧光显微镜观察细胞在支架膜上的形态和分布结果表明，静电纺丝制备的CS/PCL血管支架综合了CS和PCL二者优点，具有良好的细胞相容性，表面多孔结构利于细胞黏附生长；
　　(2)通过同轴静电纺丝的方法，制备“核-壳”结构的微纳米纤维支架，其中，以L-聚乳酸(PLLA)和聚乙二醇(PEG)混纺作为纤维的壳层，将抑制血管再狭窄的药物雷帕霉素负载于纤维的核层。分别考察了PLLA纤维支架的形貌、结构与力学性能，高效液相测量药物的包封率和负载率。实验结果表明，壳层纺丝液两溶质PLLA和PEG的质量比为7:3、PLLA质量分数为2％、外加直流电压为10kV、核壳推进速度分别为V核=0.1mL/h、V壳=1mL/h时，纺制能够形成表面光滑、直径分布较窄的纳米纤维的载雷帕霉素的PLLA纤维支架。雷帕霉素的加入削弱了PLLA纤维支架的力学性能，拉伸强度及断裂伸长都有轻微的下降，弹性模量下降明显。同轴静电纺丝携带雷帕霉素的包封率和负载率均高于混纺携带药物，且随着所包载雷帕霉素(RAPA)药物浓度的增大，包封率和载药量均降低，说明同轴静电纺丝体系的稳定性影响着药物的包封；
　　(3)对“核-壳”结构的载雷帕霉素的PLLA纤维支架的体外缓释溶液的释药行为进行了考察。采用常用的体外释药模型，对其体外释药行为进行了零级动力学模型、一级动力学模型和Higuchi动力学模型拟合，考察雷帕霉素从多孔PLLA纤维支架中的释放规律，对释药机理进行初步探索。结果表明，PLLA纤维支架的体外缓释实验中，雷帕霉素突释现象不明显，在助溶剂为SDS时，在24h累计释放率仅为20％左右，之后药物释放几乎呈直线型释放，释放速度比较平稳。在20天内90％的药物释放出来了，缓释效果长达20天左右，具有明显的缓释效果。SDS的加入，促进了RAPA的释放，相反甘油的加入反而抑制了药物的释放。说明在缓释溶液里加入助溶剂，有助于改善药物的溶解度，从而促进药物释放。载RAPA的PLLA纤维支架在添加不同助溶剂及同一助溶剂的不同浓度的体外缓释溶液中，均符合一级动力学方程，较符合Higuchi动力学模型，基本符合零级动力学方程，纤维支架主要通过膨胀释放药物；
　　(4)结合两性离子材料磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯(SBMA)的优良的抗蛋白质吸附性能和多巴胺(DOPA)衍生物邻苯二酚(catechno1)的粘附功能，首先通过ATRP的方法合成三种不通分子量大小的pSBMA-catechno1，而后接枝到(“graftto”)PLLA血管支架表面，进行表面改性。测定PLLA纤维支架改性前后表面形态结构、表面元素组成、亲疏水性能、并考察改性溶液和pSBMA-catechno1分子量大小对改性PLLA纤维支架的抗蛋白质性能的影响。SEM结果显示，PLLA纤维表面原本光滑的表面结构粗糙度增加并有颗粒状沉积物。XPS结果表明，改性后的PLLA相对于未改性的PLLA的XPS图谱发生了显著变化，除了出现PLLA的C1s，O1s峰之外还出现N1s和S2p峰，证明pSBMA-catecho1接枝到PLLA纤维支架表面。FITC-BSA标记的抗蛋白吸附实验表明在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)改性溶液中加入乙醇，蛋白质的非特异性吸附量大为降低；通过采用大、中、小三种不同分子量pSBMA-catecho1修饰改性PLLA纤维支架，小分子量修饰PLLA纤维支架表现出更好的亲水性和抗蛋白质吸附性能。pSBMA-catecho1修饰改性PLLA纤维支架表现出更好的抗蛋白质吸附性能。酶标记免疫吸附测定法(ELISA)实验也显示pSBMA-catecho1改性PLLA纤维支架的纤维蛋白原(Fg)吸附量相对于PLLA空白对照下降了近90.5％，与阴性对照相差不大。上述结果表明，pSBMA-catecho1两性离子聚合物修饰改性可有效抑制蛋白质的非特异性吸附，表现出良好的生物相容性。该研究为PLLA纤维支架的两性离子改性提供了一个方便而有效地改善其生物相容性的表面改性方法。
　　综上所述，本文分别通过静电混纺改善纤维支架的力学性能，并通过同轴静电纺丝制备了“核-壳”结构的药物微纳米纤维而实现功能化。通过对缓释曲线进行动力学模型拟合，阐明药物体外释放规律及机理，并将pSBMA-catecho1两性离子聚合物接枝到(“graftto”)PLLA纤维支架表面进行表面改性，大大改善了其生物相容性，这些结果对于以后构建形态结构及性能上更优的组织工程支架具有一定的指导作用。