人Lipocalin型前列腺素D合成酶的真核表达及单克隆抗体的制备

摘要

Lipocalin型前列腺素D合成酶(Lipocalin-type Prostagladin D Synthase,L-PGDS)亦称β-trace protein,是机体组织屏障的主要成分,属Lipocalin家族.Lipocalins为一组分子量较小的分泌性蛋白质,它们的共同特性是可结合和运输亲脂/疏水分子,L-PGDS为此家族中惟一有酶活性者.为了建立L-PGDS的免疫学检测方法并探讨其在男性生殖系统中的具体功能、代谢过程、作用机制以及与男性不育的关系等,就必须得到大量的纯化L-PGDS抗原和相应的抗体.

目录

引言

第一部分Lipoca1in型前列腺素D合成酶真核表达载体的构建

1材料和方法

1.1主要实验材料、仪器和试剂

1.2引物设计与合成

1.3 测序载体的构建及鉴定

1.4 pPIC9/htL-PGDS重组表达质粒的构建

1.5重组质粒的鉴定

2结果

2.1 L-PGDS的扩增结果

2.2测序载体的构建和序列分析

2.3 L-PGDS真核表达载体的构建

3讨论

第二部分L-PGDS酵母表达菌株的建立

1材料和方法

1.1主要实验材料、仪器和试剂

1.2主要试剂配制

1.3待转化 DNA的制备

1.4感受态酵母细胞的制备

1.5 L-PGDS基因的电转化

1.6酵母转化菌的鉴定

1.7表型的鉴定

1.8 L-PGDS表达阳性克隆的筛选

1.9不同诱导时间重组L-PGDS的表达

1.10表达量的初步分析

2结果

2.1质粒pPIC9/htL-PGDS的酵母转化

2.2表型鉴定

2.3阳性表达克隆的筛选

2.4不同诱导时间重组L-PGDS的表达

2.5表达量的初步分析

3讨论

第三部分L-PGDS的大规模诱导表达、纯化和鉴定

1材料和方法

1.1主要实验材料、仪器和试剂

1.2 L-PGDS的大规模诱导表达

1.3重组蛋白质的纯化

1.4 L-PGDS糖链的水解

1.5纯化蛋白的生物学活性检测

1.6重组L-PGDS的免疫印迹

2结果

2.1L-PGDS的表达、纯化

2.2重组L-PGDS的糖基化分析

2.3重组L-PGDS的生物学活性

2.4重组L-PGDS的Western印迹

3讨论

第四部分分泌L-PGDS单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

1材料与方法

1.1主要实验材料、仪器和方法

1.2免疫脾细胞制备

1.3饲养细胞的制备

1.4细胞融合

1.5杂交瘤细胞观察及换液

1.6分泌L-PGDS McAb阳性克隆的检测

1.7阳性克隆有限稀释

1.8腹水型单克隆抗体的制备

1.9单克隆抗体的鉴定

2结果

2.1杂交瘤细胞株的建立

2.2单克隆抗体亚类测定结果

2.3 L-PGDS McAb的效价测定结果

2.4特异性鉴定

3讨论

小结

参考文献

研究生期间主要学术成果

致谢

综述及参考文献