高致病性PRRSV-HuN4株ORF3基因的真核表达及GP3单克隆抗体的制备

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）属于套式病毒（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus），能引起猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）。临床表现为发热、流产、早产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和各年龄猪群的呼吸道症状。1987年美国首次报道该病，不久此病迅速蔓延至北美和欧洲。1996年我国首次分离到PRRSV，证明该病在我国的存在。2006年夏秋之季，我国南方大部分地区发生以高热为特征的猪病，给我国的养猪业带来巨大的经济损失，经研究证实引起该病的主要病原为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic PRRSV）变异株。PRRSV基因组为不分节段的单股正链RNA，包括9个开放阅读框（Open reading frames，ORFs）。PRRSVGP3是由ORF3基因编码的一种高度糖基化糖蛋白，在病毒的致病性、复制、装配、变异和保护性反应等方面可能具有重要意义。GP3是PRRSV各毒株之间变异性较高的蛋白之一，在病毒粒子中含量较少，其功能尚不明确。因此，本试验以HP-PRRSV HuN4株为研究对象，对GP3蛋白进行了初步研究。
　　 根据GenBank中已发表HP-PRRSV04uN4株）ORF3基因序列，经序列分析去除其位于N端的（1～49aa）一部分疏水性区域，设计合成引物。将扩增的基因克隆到pFastBae HTb杆状病毒载体中，筛选的阳性重组转移载体pF-ORF3转化至DH10Bac感受态中，获得重组表达载体rBac-ORF3。再将其转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒rAc-ORF3，经PCR鉴定证实目的基因正确地插入到杆状病毒基因组中。Western blot和IFA分析表明GP3在昆虫细胞Sf9中获得正确表达，而且具有良好的反应活性，重组蛋白分子量约27ku。
　　 将杆状病毒系统表达并纯化的GP3免疫5只6周龄的Balb/c雌性小鼠，按照常规方法制备单克隆抗体，同时用原核表达并纯化的GP3建立间接ELISA方法进行筛选，经过3轮筛选和克隆，获得3株能够稳定分泌GP3特异性抗体的阳性细胞克隆株，分别命名为1C7、2DI、4C6。用间接ELISA方法测得的1C7细胞上清抗体效价为1:256，腹水效价为1:12800:2D1细胞上清抗体效价为1:3×105.0，腹水效价为1:1.6×107.0；4C6细胞上清抗体效价为1:1024，腹水效价为1:25600。3株单抗都是针对k链抗体，其中1C7和4C6分泌抗体属于IgM亚类，2D1分泌抗体属于IgG2b亚类。利用PRRSV感染的Marc-145细胞进行间接免疫荧光试验，结果表明3株单抗均发生特异性反应。本试验利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达HP-PRRSV HuN4株GP3蛋白，并制备了3株抗GP3的单抗，为进一步研究GP3的结构功能以及HP-PRRSV的致病机理奠定基础，对开发有效的疫苗及诊断试剂有着重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

Contents

1 引言

1.1 杆状病毒表达系统简介

1.1.1 杆状病毒

1.1.2 杆状病毒表达系统

1.1.3 杆状病毒表达系统在研究中的应用

1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒简介

1.2.1 病原学

1.2.2 分子生物学

1.3 高致病性猪繁殖与呼吸综合征

1.3.1 流行情况

1.3.2 临床症状及病理变化

1.3.3 HP-PRRSV遗传变异分析

1.3.4 诊断

1.3.5 防制

1.4 单克隆抗体的简介

1.5 研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 毒株、细胞

2.1.2 载体、菌株、血清及实验动物

2.1.3 试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 病毒RNA的提取

2.2.3 目的基因的扩增

2.2.4 目的基因的克隆

2.2.5 原核表达载体的构建

2.2.6 ORF3基因在大肠杆菌中的诱导表达

2.2.7 包涵体的纯化、复性与Western blot鉴定

2.2.8 真核表达载体的构建

2.2.9 重组杆粒的获得与鉴定

2.2.10 重组杆状病毒的获得与鉴定

2.2.11 重组蛋白的表达及免疫学鉴定

2.2.12 小鼠免疫

2.2.13 间接ELISA方法的建立

2.2.14 单克隆抗体的制备

2.2.15 单克隆抗体的特性鉴定

3 结果

3.1 基因的扩增与转移载体的构建

3.2 重组质粒pMD18-ORF3的酶切鉴定

3.3 原核表达载体的双酶切鉴定

3.4 ORF3基因在大肠杆菌中表达、纯化及Western blot结果

3.5 真核表达载体的构建结果

3.6 重组杆粒的PCR鉴定

3.7 重组杆状病毒PCR鉴定

3.8 ORF3基因在昆虫细胞中的表达、纯化及Western blot鉴定

3.9 重组杆状病毒IFA鉴定

3.10 ELISA方法建立结果

3.10.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定

3.10.2 间接ELISA其他工作条件的摸索

3.11 细胞融合与筛选结果

3.11.1 动物免疫

3.11.2 细胞的融合率

3.11.3 阳性杂交瘤细胞的筛选结果

3.12 单克隆抗体的特性鉴定结果

3.12.1 上清及腹水效价测定

3.12.2 单克隆抗体亚类的鉴定

3.12.3 特异性鉴定

3.12.4 单克隆抗体的Western blot鉴定

3.12.5 间接免疫荧光

4 讨论

4.1 目的基因的选择

4.2 免疫抗原和筛选抗原的选择

4.3 小鼠的免疫

4.4 细胞融合

4.5 单抗特性的鉴定

5 结论

致 谢

参考文献

附 录

攻读学位期间发表的学术论文