钙敏感性受体和活性维生素D在钙磷平衡和骨骼代谢中的相互作用及机制研究

摘要

为了研究钙敏感性受(CaSR)和活性维生素D[1，25(OH)2D3]在钙磷平衡和骨骼代谢中的相互作用及机制，我们建立了CaSR和25羟维生素D-1-α羟化酶[1 α(OH)ase]双基因敲除[CaSR-/-1α(OH)ase-/-]小鼠模型，比较分析了2周龄CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠与相应单基因敲除及野生型(WT)同窝小鼠的表型差异。 与先前的研究结果一致，约85％的CaSR-/-小鼠在出生后两周内死亡，幸存至两周者体格小，体重轻，血钙明显升高，血磷降低，血甲状旁腺素(PTH)水平明显升高，甲状旁腺肥大。两周龄1 α(OH)ase-/-小鼠表现为轻度低钙低磷血症，血PTH升高50％，甲状旁腺中度肥大，但能存活到成年。CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠生存期较CaSR-/-小鼠延长，2周和4周龄CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠生存率分别为91％和42％。2周龄CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠体重较CaSR-/-小鼠明显增加，血钙正常，血磷较CaSR-/-和1α(OH)ase-/-小鼠低，血PTH水平较CaSR-/-小鼠更高。这些结果说明，1α(OH)ase基因敲除能通过纠正CaSR-/-小鼠的高钙血症而延长其存活期，但由于更严重的高PTH血症致使CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠不能存活至成年。 为了明确CaSR和1,25(OH)2D3在骨骼生长发育过程中的相互作用，我们通过影像学和组织学比较分析了2周龄不同基因型小鼠骨骼的表型差异。CaS-/-小鼠表现为严重的骨骼生长障碍，包括长骨短小，钙化的次级骨化中心缺如，骨密度降低，但干骺端小梁骨密度增加。1α(OH)ase-/-小鼠长骨略短，钙化的骺端较小，骨密度轻度降低。CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠长骨长度、皮质骨和小梁骨密度均较CaSR-/-小鼠明显增加。这些结果说明1α(OH)ase基因敲除能够部分改变CaSR缺失引起的严重的骨骼生长发育。 为了明确CaSR和1，25(OH)2D3在软骨内成骨中的相互作用，我们通过组织学和免疫组织化学的方法分析比较了2周龄不同基因型小鼠生长板的表型差异。CaSR-/-小鼠表现为次级骨化中心形成延迟，增殖细胞核抗原(PCNA)阳性软骨细胞减少，软骨细胞肥大带明显增宽。1 α(OH)ase-/-小鼠生长板和肥大带宽度较WT小鼠稍有增宽。在2周龄CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠，次级骨化中心已开始形成，肥大软骨细胞中已开始出现血管和成骨细胞。生长板和肥大带宽度较CaSR-/-小鼠明显变窄，而PCNA阳性软骨细胞则较CaSR-/-小鼠明显增加。鉴于甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP)在软骨细胞增殖和分化中起有重要作用，我们通过PTHrP免疫组织化学染色发现PTHrP阳性细胞在CaSR-/-小鼠明显减少，而在CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠则较CaSR-/-小鼠有所增加，但没有达到WT小鼠的水平。这些结果说明，1 α(OH)ase基因敲除能够通过上调PTHrP，增加软骨细胞的增殖而起到部分纠正CaSR缺失引起的软骨内成骨的严重障碍。 为了明确CaSR和1，25(OH)2D3在骨形成和骨吸收中的相互作用，我们通过组织学，组织化学和免疫组织化学及图像分析检测了两周龄不同基因型小鼠骨组织的表型差异。与WT小鼠相比，成骨细胞数、小梁骨容量和骨钙素(OCN)阳性面积在CaSR-/-小鼠均明显增加；在1α(OH)ase-/-小鼠则有所减少，而在CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠增加更为明显。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性破骨细胞数在CaSR-/-小鼠增加，在1α(OH)ase-/-小鼠减少；而在CaSR-/-1α(OH)ase-/-小鼠与WT小鼠相似。NF-kB受体活化素配体(receptoractivatior of NF-kB ligand，RANKL)阳性细胞和面积变化与成骨细胞的变化一致。这些结果说明，CaSR缺失引起的成骨细胞骨形成增加是由于PTH过代偿作用的结果。 本研究进一步阐述了CaSR和1,25(OH)2D3在调节钙磷平衡，甲状旁腺细胞生长和PTH产生以及软骨内成骨和成骨细胞骨形成中的相互作用的机制，为后续研究和临床相关疾病的诊治提供了实验和理论依据。

目录

论文说明:缩写词

声明

前言

材料与方法

1.实验动物

2.动物基因型鉴定

3.X射线摄影、micro-CT扫描及三维重建试验

4.HE染色

5.总胶原组织化学染色

6.Von Kossa组织化学染色

7.抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase TRAP)组织化学染色

8.免疫组织化学染色

9.血钙、血磷、血PTH测定

10.统计分析

结果

1、1α(OH)ase基因敲除延长CaSR-/-小鼠的生存期，并部分改善了它们的生长发育

2、1α(OH)ase基因敲除能够纠正CaSR-/-小鼠的高钙血症，但却造成了更严重的高PTH血症

3、1α(OH)ase基因敲除部分纠正了CaSR-/-小鼠的骨骼生长障碍

4、1α(OH)ase基因敲除部分改善了CaSR-/-小鼠软骨内成骨的障碍

5、1 α(OH)ase基因敲除进一步增加了CaSR缺失引起的成骨细胞骨形成增加

讨论

小结

参考文献

致谢

综述：钙的生理作用与调节