人NR4A1基因重组腺病毒载体构建及其在多囊卵巢综合征病理机制研究中的初步应用

摘要

目的：NR4A1(又称Nur77、TR3或NGFI-B)是甾体激素/甲状腺激素/类维生素A受体超家族成员中的一员，其通常作为转录调控因子调控基因的表达。在前期研究工作中，我们通过基因芯片杂交技术筛选出正常人和PCOS患者卵巢组织中290个差异表达的基因，NR4A1是该差异表达谱内代表性基因之一，其在PCOS患者卵巢中表达下调(正常/PCOS=0.4)。既往大量的研究表明NR4A1在许多重要组织中均有表达，其功能涉及细胞凋亡/增殖、甾体激素代谢、神经信号传导等诸多方面。但是，有关NR4A1在PCOS发生发展过程中的作用尚未有过报道。本研究通过构建人NR4lAl基因重组腺病毒载体及小鼠卵泡体外培养的方法，实现NR4A1基因在小鼠卵泡膜细胞内的超表达。在此基础上，观察NR4lAl基因超表达对卵泡膜细胞雄激素生成的影响。该研究为我们进一步探讨NR4A1在PCOS复杂病理生理改变过程中的分子调控机制奠定了基础。 方法：(1)周RT-PCR的方法从人卵巢组织中扩增NR4A1基因全长，经T/A克隆后，亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上，构建穿梭质粒pAdtrack-NR4A1。pAdtrack-NR4Al经酶切和测序鉴定后，用PmeⅠ酶切使其线性化，然后通过“两步转化法”分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdtrack-NR4A1转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组得到AdCMV-NR4A1重组腺病毒质粒。PacⅠ酶切线性化重组质粒AdCMV-NR4A1后通过脂质体转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。AdCMV-NR4A1转染AD-293细胞2-3天后见GFP表达，转染10～12 d后当90％以上细胞出现细胞病变(CPE)时，收集病毒上清。用收集的病毒上清再次感染AD-293细胞，重复感染四次，实现病毒大量扩增。最后，取1μl病毒上清进行PCR反应验证上清中NR4A1基因的存在；抽提AdCMV-NR4A1感染的AD-293细胞蛋白，Western blot验证NR4A1蛋白的表达。 (2)从20日龄小鼠卵巢中分离并挑选出200μm的卵泡，置于96孔板中进行体外培养，培养24小时后挑选形态、色泽良好的卵泡转移至新孔中，予AdCMV-NR4A1重组病毒直接加入卵泡培养液中感染卵泡膜细胞。病毒感染卵泡48小时后分别提取卵泡RNA及卵泡蛋白，通过RT-PCR及Western blot的方法验证NR4A1在卵泡膜细胞中的超表达。同时，收集卵泡的条件培养液，用超敏感的固相放射免疫方法检测培养液中睾酮的浓度，比较NR4A1超表达组及阴性对照组睾酮值的差异。 结果：(1)用RT-PCR方法，从人卵巢组织中扩增出1797 bp的cDNA，测序证实为人NR4A1基因。在此基础上，通过BJ-5183细菌内同源重组的方法构建了NR4A1基因的重组腺病毒质粒AdCMV-NR4A1及对照质粒AdCMV。重组质粒转染AD-293细胞后经过包装、扩增最终得到高滴度重组病毒，以GFP为标志测定AdCMV-NR14A1病毒滴度为107U/ml，AdCMV病毒滴度为108 U/ml。(2)成功建立小鼠窦前卵泡体外培养的方法，小鼠窦前卵泡体外培养4天，达90％～X上的成活率。借助小鼠卵泡体外培养模型，实现了NR4A1在卵泡膜细胞内超表达。与对照组相比，在NR4A1超表达组中NR4A1 mRNA和蛋白的表达水平均升高，两组间差异显著(p<0.05)。最后，用RIA检测NR4A1在小鼠卵泡膜细胞内超表达后睾酮分泌的变化，结果显示：与对照组相比，实验组中睾酮浓度明显降低，两组间差异显著(p<0.05)，该结果表明NR4A1在小鼠卵泡膜细胞内超表达明显抑制了卵泡膜细胞睾酮的分泌。 结论：(1)本文在成功克隆人NR4A1基因的基础上，构建NR4A1重组腺病毒载体。人NR4A1基因重组腺病毒载体的构建为进一步研究NR4A1在PCOS发生发展中的作用及其机制奠定了基础。(2)建立起小鼠窦前卵泡体外培养模型，该模型为进一步研究与PCOS发病相关的差异基因、蛋白的功能及其作用机制提供了良好的平台。(3)NR4A1基因在小鼠卵泡膜细胞内超表达后明显地抑制了卵泡膜细胞睾酮的分泌，表明NR4A1与卵泡膜细胞雄激素的生成相关。PCOS患者卵巢中NR4A1的低表达与其临床上所表现出的高雄激素血症可能存在一定的联系。

目录

声明

摘要

前言

第一部分：人NR4A1基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建和鉴定

一.NR4A1基因的克隆及其序列测定

二、AdCMV-NR4A1重组腺病毒载体的构建和鉴定

讨论

第二部分NR4A1基因对小鼠卵泡膜细胞雄激素分泌的影响

一、小鼠卵泡的体外培养

二、NR4A1基因在小鼠卵泡膜细胞内的超表达

三、NR4A1基因超表达后对卵泡膜细胞雄激素分泌的影响

讨论

总结

参考文献

附录 在读期间发表的论文及综述

致谢

综述一：孤儿核受体NR4A1的研究进展

综述二：青春期多囊卵巢综合征及其代谢特征