腺病毒介导的人白介素－24基因重组载体在制备肿瘤镇痛药物中的应用

摘要

本发明公开了人白介素－24基因腺病毒载体在制备治疗癌痛药物中的应用。包括以下步骤：(1)构建重组转移质粒pAdTrack－CMV－IL－24；(2)用测序正确的pAd－TrackhCMV－IL－24按照常规方法制备阳性克隆pAdEasy－l－pAdTrack－CMV－IL－24；(3)将pAdEasy－l－pAdTrack－CMV－IL－24基因重组质粒进行病毒包装，经多轮扩增后，可获高滴度的重组腺病毒子(Ad－IL－24)。(4)用Ad－IL－24感染肿瘤组织，并结合大鼠胫骨癌痛模型的镇痛测试，结果不仅证明了Ad－24具有共识的抑癌功能，而且腺病毒介导白介素－24基因在细胞中的表达可以通过多种途径发挥抑制癌痛的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及腺病毒介导白介素-24基因的新应用，具体涉及腺病毒介导白介素-24基因在镇痛领域的应用。

背景技术

近年来肿瘤发病率逐年上升，据WHO统计，全球每年新发癌症患者约1000万以上，其中30-50％伴有不同程度的癌痛，缓解或控制癌痛成为减轻患者痛苦、提高生存质量的工作重点之一。近年来随着癌痛动物模型的不断改进，癌痛机制的研究也日益完善，癌痛的治疗方面也取得了较好的发展。

1.经研究发现癌痛的发生机制主要有以下几种：

1.1 初级感觉神经元兴奋性异常增加：初级感觉神经元位于脊髓背角神经节(DRG)，分布着感受不同刺激的受体，可将各种伤害性刺激转化为电化学信号传导中枢神经系统。在持续的外周刺激下，DRG神经元发生可塑性变化，外周神经敏感性增加，表现为痛阈降低、痛觉过敏和触诱发痛。研究表明，肿瘤组织能释放某些细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素(PGE)、内皮素(ET)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)等，这些因子可能作用于初级感觉神经元上相应的受体，激活和敏化感受器，参与癌痛的产生。

1.2 脊髓的神经化学变化：肿瘤细胞通过释放细胞因子导致初级感觉神经元异常兴奋，异常兴奋的神经元不断向上一级神经元发放冲动，再经不同的上行传导束到达高级中枢。初级感觉神经元异常兴奋使脊髓胶质细胞合成、释放新的递质如ET-1对原有的递质如P物质(SP)、SP受体(SPR)等进行调节。研究发现在骨癌痛模型中，模型组的鼠患侧肢体相应的脊髓节段存在神经化学变化，包括星形胶质细胞增生、谷氨酸重摄体转运体减少、脊髓SP受体内吞、III～IV层强啡肽、I层神经元c-fos表达增加等，而正常动物中只有在伤害性刺激下才能出现上述变化，提示骨癌痛时存在外周传入神经敏化。其中星形胶质细胞与癌痛密切相关，经疼痛相关物质活化后的星形胶质细胞通过释放多种神经活性物质直接影响神经元可塑性，促进初级传入末梢释放多种致痛物质。另外，星形胶质细胞能释放一系列的细胞因子和生长因子，改变周围的神经化学环境，参与痛觉信号的传递。

1.3 骨溶解：对发生骨转移的肿瘤病人进行骨代谢分析发现，骨癌痛的发生与肿瘤所致的骨质破坏密切相关。同样动物实验结果显示，肿瘤刺激破骨细胞，引起骨溶解和骨形成的失衡，产生明显的骨质破坏，而且其破坏程度与痛行为、脊髓背角神经节(DRG)的神经化学改变呈正相关。破骨细胞的过度活跃是骨癌痛发生的前提，RANKL-RANK-OPG调节轴是破骨细胞分化和活化的主要调节形式。RANKL及其信号转换受体RANK具有刺激破骨细胞前体分化为破骨细胞、增强破骨细胞活力的作用，而骨保护素(OPG)作为诱饵受体，能与其配体RANKL以高亲和力结合，阻止RANKL与RANK的结合，抑制破骨细胞参与骨吸收。因此RANKL和OPG的比例决定了破骨细胞介导的骨质破坏的程度。在肿瘤分泌的多种因子参与下，RANK经RANKL激活后，通过IKK、INK、p38、ERK、c-Src酪氨酸激酶等蛋白激酶途径实现信号传导，影响基因表达，调节OC和蛋白酶水平，激活破骨细胞。

1.4 其他方面：肿瘤发展到后期，随着肿瘤体积的增大，局部组织压力增加，压迫支配该部位的神经纤维末梢，引起机械损伤、压迫和缺血。同时，肿瘤释放的化学因子、细胞因子、生长因子等不但破坏局部组织，也破坏支配局部组织的神经组织，这些都会导致神经病理性疼痛的发生。此外一些学者发现趋化因子通过CXCL8/CXCR1途径、CCL/CCR途径、CX3CL1/CX3CR1途径、CCL2/CCR2途径在癌痛镇痛发挥着一定的作用。

同时，关于癌痛的治疗，已知的途径有以下几种：

2.1 药物治疗：药物止痛是处理癌痛最基本和最常用的方法。止痛药物的使用原则，应遵照WHO推荐的药物治疗癌痛的5个要点，即口服、按时、按阶梯、个体化给药、注重具体细节，其核心是“按时”给药和“按阶梯”给药。常用的药物包括非甾体类抗炎药、曲马多、双磷酸盐类药物、麻醉性镇痛药、NMDA受体拮抗剂、中枢α2受体激动剂、三环类抗抑郁药、皮质激素、抗惊厥药物等，常用的给药途径有口服给药、肌内给药、直肠用药、皮肤与粘膜用药。癌痛治疗满意的标准是第1周疼痛缓解，第2周尽量减少爆发性疼痛的发生，第3周维持稳定的止痛疗效，不同时间分别进行疼痛评估并采取针对性的治疗。

2.2 放射治疗：放疗对癌症压迫或浸润神经以及局限性骨转移引起的疼痛治疗效果良好。对控制癌痛有帮助的常用放疗方式有：远距离放疗、近距离放疗、全身放射性核素、间接疗法。

2.3 外科手术治疗：通过外科手术切除肿瘤，取出了疼痛的病因；对于肿瘤压迫、刺激所致的梗阻性疼痛，外科手术也属必需而有效的治疗方法，即使是姑息性手术也可使疼痛得以持续时间最长、效果最佳的缓解。可以达到消除和减轻疼痛、延长寿命、减低残废率和提高生存质量的目的。

2.4 癌痛的介入治疗：对于经过规范的药物治疗后仍不缓解的顽固性癌痛，可以采用微创介入治疗，如射频神经毁损性阻滞。目前临床上常用周围神经、神经根、蛛网膜下腔、腹腔神经丛及脑垂体毁损。采用经皮颈髓射频毁损前外侧脊髓丘脑束可治疗累计多个皮区，包括肺脏的进行性、复杂的难治性癌痛。射频神经毁损具有定位准确、程度可控制、能进行试验性电刺激、可在麻醉下进行、损伤组织恢复时间段、比药物性毁损安全性高等优点。

2.5 化学治疗：化学治疗是控制癌痛的一种必要的手段，它可以丛病因上消除肿瘤所致的疼痛。化疗主要适用于手术不能切除、多发性病灶的肿瘤患者，尤其是对骨肉瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、白血病等引起的压迫或浸润神经或骨组织引起的疼痛能迅速显效。

2.6 激素治疗：随着雌激素的合成与雌激素受体(ER)、雌激素受体调节剂(SERM)的发现，研究发现：ERα和ERβ可能与不同的SERMs作用靶位有关。雷洛昔芬、阿佐昔芬(Arzoxifene)是合成的第二代雌激素拮抗剂，预防和治疗乳腺癌有确切的疗效；托瑞米芬(Toremifene)结构上与三苯氧胺相似，已证实对绝经后妇女乳腺癌有效。GW5638也是一种SERM药，可用于耐三苯氧胺乳腺癌及骨转移的治疗。

去除雄激素(去势)是治疗前列腺癌骨转移的有效方法，也能有效缓解骨癌痛。

2.7 细胞水平的治疗：细胞水平的癌痛治疗主要有细胞植入治疗和基因治疗两种方法。细胞植入治疗是将体外培养的自体细胞或细胞株植入体内，通过类似生物泵(bio-mininpump)的作用让这些移植细胞持续分泌抗痛蛋白、抗痛蛋白调控因子、酶或信号转导因子，从而增强抗痛蛋白的表达，达到镇痛效果^[30].通过基因重组和载体构建消除嗜铬细胞的致瘤性，嗜铬细胞已被成功安全地用于难治性癌痛病人的疼痛治疗。疼痛基因治疗主要有两个方向：一个是利用基因重组技术将某些抗痛基因、调控基因、受体基因等外源基因插入载体，导入神经元，上调抗痛基因的表达；另一个是利用反义寡核苷酸技术和RNA干扰技术，引起目的mRNA降解，抑制转录过程从而下调神经系统内源性疼痛分子的表达来达到镇痛目的。

2.8 心理治疗：恶性肿瘤患者常伴有焦虑和抑郁情绪而使病情加重，对癌性疼痛患者的心理治疗的目的是减少癌痛患者的心理障碍，增强患者的治疗信心，改善患者的痛觉，提高患者应付疼痛的能力。心理治疗可与止痛药物结合来控制疼痛，但不能取代癌痛的药物治疗。心理治疗方法包括催眠术、松弛疗法、生物反馈调节、精神治疗及认知行为治疗等。

绝大部分癌痛是由肿瘤组织浸润造成的，最有效的治疗癌痛的方法是抗癌治疗。在癌痛的治疗中，今后比较理想的镇痛方法是给药途径便捷，不良反应轻，发挥作用持久；细胞水平的镇痛技术由于其具有较好的可控性、安全性和组织相容性，将会逐渐成为一种治疗方法，从而持续有效地消除疼痛；限制药物的不良反应；将疼痛及治疗带来的负性情绪减少至最低；最大限度地提高患者的生存质量，维护生命的尊严。

关于腺病毒介导白介素-24(Ad-IL-24)的报道，主要集中在其抑制肿瘤方面的应用，近年来国外大量研究资料已证明，Ad-IL-24对肿瘤有抑制生长和促进凋亡作用，并能调节IL-6，TNF-α，IFN-γ等细胞因子的分泌；在国内本课题组成员对此作了大量的研究，研究结果显示Ad-IL-24具有特异的抗肿瘤作用，对正常细胞无伤害作用；在美国Ad-IL-24已经进入肿瘤基因治疗的I期临床；然而Ad-IL-24对癌痛的治疗作用，国内外至今未见报道。关于它在肿瘤镇痛方面的应用未见报道。

发明内容

本发明目的是提供一种含有腺病毒介导白介素-24基因的治疗癌痛的药物，减缓伴随肿瘤的癌痛。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：腺病毒介导白介素-24基因表达载体(Ad-IL-24)在制备治疗癌痛的药物中的应用。

本发明采用的技术方案包括以下步骤：

(1)按照常规方法，构建IL-24转移载体质粒pAdTrack-CMV-IL-24；

(2)将测序正确的pAd-TrackhCMV-IL-24基因重组转移质粒用PmeI单酶切线性化后，胶回收并与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒采用氯化钙法共转化BJ5183感受态细胞，经酶切鉴定获阳性克隆后，即为腺病毒介导白介素-24基因重组质粒(pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-IL-24)；

(3)将pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-IL-24基因重组质粒经PacI酶切线性化后，按Lipofectamine Reagent操作说明转染70％贴壁的QBI-293A细胞，进行病毒包装，经多轮扩增后，可获高滴度的重组腺病毒子(Ad-IL-24)。

(4)按照常规方法，用步骤(3)所得的Ad-IL-24感染癌细胞或骨癌痛动物模型的癌肿局部组织。

本发明运用上述技术方案与现有技术相比具有下列优点：

腺病毒介导白介素-24基因Ad-IL-24不仅具有抑制肿瘤细胞生长的作用，而且可以通过多种途径发挥抑癌镇痛作用，例如：Ad-IL-24在细胞中表达的IL-24可使缓解疼痛的β-内啡肽细胞因子表达水平上调和使诱发疼痛的炎性因子IL-6表达水平下调，因此能在一定程度上缓解模型大鼠的机械痛敏，具有缓解疼痛作用。

附图说明

附图1：实施例中重组腺病毒Ad-IL-24对Walker256细胞的生长抑制曲线；

附图2：实施例中FCM检测各组Walker256细胞凋亡率；

附图3A：实施例中术侧机械痛敏阈值的测量；

附图3B：实施例中对侧机械痛敏阈值的测量；

附图4：实施例中ELISA试剂盒测大鼠血浆中细胞因子浓度。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：参见附图1至附图4所示，证明Ad-IL-24能抑制Walker256癌细胞生长并诱导其凋亡，在用Walker256细胞建立的SD大鼠胫骨癌痛模型中，用唑来磷酸做阳性对照，研究证实Ad-IL-24与唑来磷酸一样在肿瘤组织中具有抑制癌痛的作用，具体步骤如下：

1.1 材料

QBI-293A细胞、大鼠乳腺癌的腹水瘤Walker256细胞、pcDNA3.0-IL-24重组质粒、pAdTrack-CMV质粒、pAdEasy-1骨架质粒、BJ5183细菌等均为本实验室保存；

Pme I酶、Pac I酶、MMLV逆转录酶，Bgl II酶、SalI酶、Taq酶购自MBI公司；RPMI-1640购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自杭州赛乐生物有限公司；MTT购自Sigma公司；检测TNF-α、IL-6、β-内啡肽、IFN-γ的ELISA试剂盒(晶美生物技术公司，上海)；唑来膦酸(天晴药业，江苏)；

动态足底触觉测量仪(UGO Basile公司，意大利)；辐射热测痛仪(中国科学院生物医学工程公司)。

雌性SD大鼠40只，体重180—200g，由苏州大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒载体构建及鉴定

1.2.1.1 IL-24 转移载体质粒的构建

根据hIL-24序列合成引物，上游：5’-gcactcgagaccatgaattttcaacagaggctgca-3’，下游：5’-gcttctagatcagagcttgtagaatttctg-3’。以本室构建的pcDNA3.0-hIL-24重组质粒为模板，PCR扩增hIL-24基因片段；

将hIL-24基因片段和带有GFP标记基因的pAdTrack-CMV转移质粒，经XhoI、XbaI双酶切后，用胶回收目的片段，再由T4DNA连接酶连接过夜，氯化钙法转化DH5a感受态细胞，筛选pAdTrack-CMV-IL-24基因重组转移质粒的阳性克隆，进行PCR、双酶切和测序鉴定，将鉴定正确的细胞-80℃保存，以备后用。

PCR、双酶切和测序鉴定过程如下：将获得的阳性克隆抽提质粒，经XhoI、XbaI双酶切鉴定和琼脂糖电泳，在620bp附近有目的条带，PCR鉴定在相同位置也有目的条带。目的条带的测序结果与GenBank报道的序列完全一致，表明pAdTrack-CMV-IL-24基因重组转移质粒构建成功。

1.2.1.2 重组腺病毒载体构建

将测序正确的pAd-TrackhCMV-IL-24基因重组转移质粒用PmeI单酶切线性化后，胶回收并与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒采用氯化钙法共转化BJ5183感受态细胞，经切鉴定获性克隆，即为pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-IL-24重组腺病毒质粒，质粒经扩增提取后再转化DH5α感受态细胞，同时用pAdTrack-CMV空转移质粒与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒共转化BJ5183，以制备阴性对照的腺病毒空载体质粒pAd-GFP。pAdTrack-CMV图谱及重组腺病毒构建流程见文献(SuZZ，Madireddi MT；Lin JJ，et al.Proc Natl Acad Sci U S A.Nov 24 1998；95(24)：14400-14405.)。

鉴定结果显示：pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-IL-24重组腺病毒质粒(简称pAd-IL-24)和pAdEasy-1-pAdTrack-CMV空载体腺病毒载体质粒(简称pAd-GFP)构建成功。

1.2.1.3 重组病毒子的获得

碱裂解法大抽pAd-IL-24质粒和pAd-GFP质粒，经PacI线性化后，按Lipofectamine Reagent操作说明转染70％贴壁的QBI-293A细胞，在荧光显微镜下3～5d观察荧光，7～10d将细胞反复冻融3次，2000r/min离心5min，取病毒上清，经多轮感染扩增后，可获得高滴度(效价均达到10⁹pfu/ml)基因重组腺病毒子(Ad-IL-24)和空载体腺病毒子(Ad-GFP)于80℃保存。

1.2.1.4 重组病毒子鉴定

用100MOI的Ad-IL-24和Ad-GFP分别感染QBI-293A细胞48h后，1000r/min离心收集细胞，PBS洗涤细胞2～3次，按总RNA抽提试剂盒说明书操作提取RNA，用IL-24的引物进行RT-PCR鉴定。

PCR的体系为94℃、4min，94℃、30s、55℃、45s，72℃、1min，30个循环，72℃延伸10min。同时收集细胞按10⁷细胞/ml细胞裂解液的比例加细胞裂解液(含终浓度为1mM PMSF蛋白酶抑制剂)进行裂解，充分裂解后12000r/min离心5min，取总蛋白上清，并以4:1的比例与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮沸5min，12000r/min离心5min，再用分离胶为12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳(100V，2h)，并300mA，2h将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，NC膜用5％脱脂奶粉37℃封闭1h；用鼠抗人IL-24抗体在37℃作用1h，TBST洗涤3次，每次5min；再分别加HRP标记的兔抗鼠IgG G二抗，37℃作用1h，TBST洗涤3次，每次5min；最后将NC膜与发光工作液(等体积A和B溶液混合)充分接触，室温孵育3min，暗室进行压片曝光、显影和定影。

检测结果如下：RT-PCR检测结果显示，Ad-IL-24组的IL-24和β-actin均出现阳性条带；空载体腺病毒Ad-GFP和PBS组均只有β-actin出现阳性条带；western-blot检测结果显示，Ad-IL-24组产生了与抗IL-24抗体结合的特异性条带，而Ad-GFP和PBS组则在相应位置均未出现上述条带。说明腺病毒介导的外源性IL-24目的基因能在293A细胞中获成功转录和表达。

1.2.1.5 重组病毒子效价检测

将培养生长状况良好的QBI-293A细胞，用胰酶消化后，细胞计数，稀释细胞浓度为1O⁵个/ml后，在96孔板上按每孔100ul接种细胞，培养24h后，将收获的重组病毒子按10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8稀释后，每个稀释度按每孔100ul接种1排，37℃、5％ CO₂细胞培养箱里培养18h后，荧光显微镜下进行荧光计数。按病毒效价(pfu/m1)＝(荧光数×10)/稀释度计算病毒效价。经检测病毒效价均可达10⁹pfu/m1。

1.2.2 Ad-IL-24在Walker 256骨肉瘤细胞的表达

将IL-24重组腺病毒(Ad-IL-24)和空载体腺病毒(Ad-GFP)以100MOI的剂量分别感染Walker 256细胞。感染48h后，在荧光显微镜下和普通光镜视野下观察细胞形态和绿色荧光。结果可见细胞死亡并呈现广泛分布的绿色荧光，收集感染后的细胞，抽提总RNA，进行RT-PCR鉴定，以检测IL-24在Walker 256细胞中的表达。RT-PCR检测结果显示，Ad-IL-24组出现阳性条带，Ad-GFP组、PBS组及唑来膦酸组未见阳性条带。

说明Ad-IL-24介导的IL-24基因在Walker 256癌细胞中的成功表达。

1.2.3 MTT法检测重组腺病毒对Walker256细胞的生长抑制作用

用100MOI的Ad-GFP和Ad-IL-24分别感染Walker 256癌细胞，MTT法检测0—5d的细胞生长活力，并绘制细胞生长曲线(见图1)。由图可见Ad-IL-24对Walker 256癌细胞有明显的生长抑制作用，其中第四天抑制率可达50％左右，与Ad-GFP组和细胞对照组比较呈显著性差异(P<0.05)。

结果表明：腺病毒介导的IL-24基因表达具有特异性抑制Walker256癌细胞生长的作用，而Ad-GFP组对Walker 256细胞生长几乎无毒副作用。

1.2.4 FMC检测重组腺病毒对Walker 256癌细胞凋亡的影响

用100MOI的Ad-GFP和Ad-IL-24分别感染Walker 256癌细胞，72h后流式细胞仪检测细胞凋亡，各组凋亡抑制率见图2。

由图可见Ad-IL-24能明显诱导Walker 256癌细胞凋亡效应，其中凋亡率可达37％左右，与Ad-GFP组和细胞对照组比较均呈显著性差异(P<0.05)。

1.2.5 动物胫骨癌痛模型的建立及其Ad-IL-24的治疗

1.2.5.1 动物分组

雌性SD大鼠40只，体重180—200g，正常组不做任何处理；其余四组接Walker256细胞肿瘤细胞建立骨癌移植瘤动物模型，随机分为5组；每组8只，分别为正常组、PBS组、Ad-GFP组、Ad-IL-24组和唑来膦酸组。

1.2.5.2 大鼠胫骨癌痛模型的建立

根据Qi-Liang等的方法(参见：Qi-Liang，Mao-Ying，Zhi-Qiang Dong，et al.Biochemical and Biophysical Research Communications 2006；345：1292-1298.)并加以改进。

将大鼠用4％水合氯醛(10ml/kg)麻醉后，仰卧位固定于操作台上，安尔碘消毒左下肢皮肤，于胫骨上半部切开皮肤，充分暴露胫骨，避免损伤血管及神经。取9号注射器针头，于胫骨结节下外5mm处与骨面呈30°～45°角度朝尾侧进针，至明显突破感后拔出针头，用微量注射器抽取Walker256细胞悬液5μl，约5×10³个细胞接种至骨髓腔内，拔出注射器后用胶水封闭针孔和创面。

1.2.5.3 动物处理

在建模后第8天分别在术侧后肢局部皮下注射PBS(70μl/只)、Ad-GFP(70μl/只)、Ad-IL-24(70μl/只)和唑来磷酸(30μg/Kg)，隔天给药，共3次。

1.2.6 Ad-IL-24 对骨癌痛镇痛效果的检测

1.2.6.1 行为学观察和检测

在注射肿瘤细胞前及注射后第3、6、8、10、12、14d进行行为学观察。每次行为学测定前，应先将大鼠置于实验室中10min以上，以利于其适应环境；为了防止大鼠下肢的意外损伤，动态足底触觉测量仪机械刺激强度的上限为15g，辐射热测痛仪每次测定时间不超过20s；每天每只大鼠的手术同侧和对侧分别测2次机械刺激痛阈，每次测定间隔至少5min以上；行为学实验均在上午07：00—11：30进行，室温保持在22℃—24℃，并保持实验室环境安静。

机械痛阈的测定结果：用足底触觉测量仪测量足底术侧和对侧机械痛域结果显示，注射肿瘤细胞建模后的第3-8天，各组各时点术侧足底机械痛阈明显降低(p<0.05)，第8天经Ad-IL-24组和唑来膦酸组治疗干预后与PBS组、Ad-GFP组比较，各时点的机械痛阈明显升高(p<0.05)；而PBS组、Ad-GFP组之间差异无统计学意义(p>0.05)(见图3A)；虽然对侧的机械痛域也出现类似结果(见图3B)，但不如术侧明显。其中(g，n＝8，x±s)(＊与PBS组、Ad-GFP组比较，p<0.05)。

1.2.6.2 细胞因子测定

注射肿瘤细胞后第14d取大鼠的血液，加EDTA作为抗凝，以1000r/min离心15min，上清于—20℃保存待测，按照ELISA试剂盒的说明书分别进行TNF-α、IL-6、β-endorphin、IFN-γ等细胞因子浓度的测定。

经ELISA检测结果显示(见图4，其中(g，n＝8，x±s)(＊与PBS组、Ad-GFP组比较，p<0.05)，Ad-IL-24组与镇痛药唑来膦酸阳性对照组一样，与PBS组和Ad-GFP组相比，大鼠血浆中IFN-γ、β-内啡肽、TNF-α浓度明显升高(p<0.05)，而IL-6的血浆浓度明显下降(p<0.05)；甚至更高于唑来膦酸阳性对照组，PBS组和Ad-GFP组的各细胞因子浓度(TNF-α、IFN-γ、β-内啡肽、IL-6)无显著差异(p>0.05)。

1.2.6.3 组织学实验

注射肿瘤细胞后第14d取处死大鼠的后肢进行修剪，留下胫骨及少许组织，经4％中性甲醛溶液中固定7d，再用含10％甲酸的多聚甲醛固定液固定7d，石蜡切片，HE染色，镜下观察肿瘤生长和骨结构的破坏情况。

注射肿瘤细胞后14d的胫骨HE切片显示，正常组大鼠左侧胫骨骨髓腔内未见异常改变，PBS组和Ad-GFP组骨髓腔完全被肿瘤细胞所填充，肿瘤向外生长，骨小梁和骨皮质均完全被破坏；而Ad-IL-24组和唑来磷酸组骨小梁破坏较轻，骨皮质仍完整。

本实施例中所有统计学处理均为采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析。综上所述，IL-24不仅具有抑制肿瘤细胞生长的作用，而且还具缓解癌痛作用，这一发现为IL-24在肿瘤基因治疗中缓解疼痛的新用处提供了实验依据，并为胫骨癌痛的机制和基因治疗研究提供了新方法。