腺病毒介导的人白介素24和p16基因体外治疗肺腺癌细胞株A549的实验研究

摘要

肺癌是人类最常见和最难治愈的恶性肿瘤之一，其发生、发展和转移是一个极其复杂的多基因调控异常的过程。该病确诊时多非早期，故疗效较差。最新统计表明，肺癌死亡率上升幅度居各类肿瘤之首[1]。肺癌在临床上分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，其中前者约占肺癌发病总数的80％。虽然传统的放疗、化疗可以在一定程度上提高病人的预后情况，但由于存在负作用、转移等各种问题，目前仍缺乏有效的手段进行根治[2-4]，严重影响着人类的生命健康。因此，关于肺癌的防治研究，尤其是非小细胞肺癌的治疗研究，成为当今最受人们关注的领域之一。 近年来，随着医学分子生物学技术和理论的发展以及对肺癌发病机制认识的不断深入，尤其是DNA重组技术和基因转移技术逐步成熟，研究者们提出了利用基因转移技术向体内导入目的基因，从而对肺癌发病的分子环节进行干预的防治策略，为肺癌的治疗开辟了新途径。 本研究拟以人白介素24(hIL-24)和p16基因作为分子工具，采用重组腺病毒为基因导入载体对非小细胞肺癌中具有代表性的肺腺癌A549细胞株进行体外基因治疗的实验研究，主要探讨外源性hIL-24和p16基因的转入及异位表达对治疗A549肿瘤细胞所发挥的作用及其内在机制，以期为肺癌基因治疗研究的进一步深入奠定必要的实验基础。 研究方法： 1.分离人外周血单个核细胞，提取其RNA作为模板采用RT-PCR方法分别扩增人白介素24(hIL-24)和p16基因cDNA全部编码序列，并将其亚克隆至测序载体pMD18-T上进行测序分析。 2.将测序正确的IL-24和p16基因片断定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上分别构建穿梭质粒pAdTrack-IL24和pAdTrack-p16，然后将阳性重组子分别与腺病毒基因组质粒pAdEasy1在BJ5183工程菌中进行同源重组构建重组腺病毒质粒pAdEasy-IL24和pAdEasy-p16并加以鉴定。 3.采用脂质体DOTAP介导构建正确的重组腺病毒质粒pAdEasy-IL24和pAdEasy-p16转染包装细胞293T细胞并在其中进行重组腺病毒的包装和扩增，以氯化铯超速离心法对重组腺病毒进行纯化并对其滴度、感染效率、目的基因表达情况等指标进行检测，分别完成重组腺病毒AD-IL24、AD-p16和空质粒对照病毒AD-GFP的构建。 4.分别以构建好的重组腺病毒AD-IL24、AD-p16和对照病毒AD-GFP感染非小细胞性肺癌(NSCLC)A549细胞，并对病毒感染效率、目的基因表达水平和感染前后细胞形态、生长增殖、细胞周期、凋亡情况、凋亡相关基因BAX和BCL2以及血管内皮生长因子VEGF表达的变化进行检测分析，探讨外源性hIL-24和p16基因单独转入及联合转导对肿瘤细胞A549的生长状态所发挥的作用。 5.将已感染重组腺病毒的各组A549细胞分别进行化疗(CDDP)和放疗治疗，并对其治疗后的生长增殖、凋亡、VEGF表达的变化及肿瘤细胞杀伤率的改变情况进行检测，探讨外源性IL-24和p16基因的转入及异位表达对A549细胞化疗和放疗敏感性的影响。 实验结果： 1.成功克隆hIL-24和p16基因cDNA全部编码序列。测序分析结果显示：除p16发生一处无义突变外，其余序列与GeneBank所提供相关序列完全吻合。 2.成功构建重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-IL24和pAdTrack-p16及重组腺病毒载体pAdEasy-IL24和pAdEasy-p16。 3.成功构建重组腺病毒AD-IL24、AD-p16和对照病毒AD-GFP，滴度分别为1.2×1010、6.0×1010和6.0×1010pfu/ml。所构建重组病毒生物活性较高，可以成功感染正常人肺成纤维细胞(NHLF)和A549细胞；经免疫组化和免疫印迹法检测结果证实：目的基因IL-24和p16可在受体细胞中高效表达。 4.AD-IL24和AD-p16单独感染均可显著抑制A549细胞的生长增殖，经细胞周期分析发现二者可分别使A549细胞发生G1期和G2期阻滞；二者联合感染可发挥协同作用，增强肿瘤生长抑制作用的发挥。二者均不对正常对照细胞NHLF发生生长抑制作用。 5.AD-IL24和AD-p16的感染可引起A549细胞不同程度的凋亡，前者作用强于后者，二者联合感染可发挥协同诱导A549细胞凋亡的作用。二者对正常对照细胞NHLF无凋亡诱导作用。 6.AD-IL24的感染可以使A549细胞的促凋亡基因BAX表达上调，同时还可下调凋亡抑制基因BCL2基因和血管内皮生长因子VEGF的表达。 7.AD-p16的感染可以降低A549细胞对顺铂(CDDP)的化疗敏感性，增强A549细胞的放疗敏感性。 8.AD-IL24感染可使A549细胞对CDDP的化疗作用和放疗敏感性增强。 9.放疗可使A549细胞的VEGF表达上调，而AD-IL24则可以拮抗这种作用，下调VEGF的表达。 结论： 1.重组腺病毒pAdEasy系统可以成功介导外源性hIL-24和P16的基因转导。 2.外源性IL-24和p16基因的成功转入和异位表达对正常人肺成纤维细胞(NHLF)的生长状态无明显影响，不仅可以单独抑制肺腺癌A549细胞的生长增殖，并诱导其凋亡，二者共同转导还可以协同发挥更强的抗肿瘤生长及凋亡诱导效应。IL-24的异位表达可以调节A549细胞中凋亡相关基因BAX和BCL2的表达，使其向着有利于细胞凋亡的方向发展。 3.IL-24基因的外源性转入可以通过下调血管内皮生长因子VEGF的表达来抑制肿瘤细胞A549的血管形成和生长。 4.外源性p16基因可以降低A549细胞对顺铂(CDDP)的化疗敏感性，IL-24可以加强CDDP的抗肿瘤作用；二者均可增强A549细胞的放疗敏感性。 5.放疗可通过上调A549细胞的VEGF表达促进其血管形成和生长，IL-24可以拮抗这种作用，下调VEGF的表达，抑制肿瘤的血管形成和生长。 6.将化疗(CDDP)和放疗与适当的外源性抑癌基因导入相结合可以对A549细胞发挥更强的杀瘤作用。

目录

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英文缩写对照表

摘要

前言

第一部分人IL-24和p16基因cDNA的克隆及序列测定

第二部分人IL-24和p16基因重组腺病毒的构建与鉴定

第三部分外源性人IL-24和p16基因的转导对A549细胞增殖和凋亡的影响

第四部分外源性人IL-24和p16基因的转导对A549细胞化疗、放疗敏感性的影响

全文总结

致谢

文献综述肺癌的分子生物学及基因治疗研究进展