PDK1基因敲除小鼠中与心衰相关的长链非编码RNA(Lnc RNA)的筛选

摘要

既往的研究已经表明，长链非编码RNA(LncRNA)参与人类许多疾病的发生和发展，如癌症、HELLP综合征和短指综合征。然而，LncRNA在心力衰竭（HF）中的研究报道较少。因此，我们研究了PDK1基因心肌特异性敲除(KO)小鼠心力衰竭模型的心脏组织中LncRNA的表达谱变化。我们分别取出生后第8天(P8)和第40天(P40)的PDK1基因敲除(KO)和野生型(WT)小鼠的心脏标本，通过Arraystar LncRNA基因芯片进行LncRNA表达谱的分析筛选。KO组和WT组芯片的结果表明:在P8，表达水平变化大于1.5倍的有2024个LncRNA，而在P40，表达水平变化大于2倍的有4059个LncRNA。我们应用实时定量PCR(RT-PCR)验证了随机选择的19个LncRNAs基因表达水平的变化。同时生物信息学分析表明:mkk7，一个顺义重叠LncRNA，可能通过MAPK信号传导途径参与到心力衰竭的病理过程中。我们推测这些差异表达的LncRNA可能参与了PDK1基因心肌特异敲除小鼠心衰过程的发生发展。 第一部分 PDK1基因敲除小鼠心衰时心脏组织中LncRNA的筛选 目的:了解PDK1基因敲除小鼠心衰时心脏组织中LncRNA表达水平是否发生变化。 方法:剪小鼠尾巴裂解，抽提DNA，PCR法鉴定心肌中特异敲除(KO)的小鼠，Western blot法验证PDK1蛋白敲除水平。取出生后40天PDK1基因KO和WT小鼠各三个心脏组织混合样本，送公司做Arraystar LncRNA芯片，通过生物信息学分析，筛选出可能跟心衰相关的LncRNA，应用RT-PCR验证筛选结果。 结果:1）一共有4059个LncRNAs表达水平变化大于2倍;2）其中，2094个LncRNAs上调，1965个LncRNAs下调;3）随机验证6个LncRNA的结果有统计学意义(P＜0.05)且与芯片结果一致。 结论:1）PDK1基因敲除小鼠心衰时心脏组织的LncRNA表达水平确实发生了变化。 第二部分 PDK1基因稳定敲除小鼠心衰前心脏组织中LncRNA的筛选 目的:了解PDK1基因敲除小鼠心衰前心脏组织中LncRNA表达水平的变化。 方法:PDK1基因敲除小鼠鉴定同前;取心脏组织特异性敲除(KO)小鼠和同年龄野生型(WT)小鼠为研究对象，观察出生第6天、第8-9天小鼠心脏PDK1蛋白水平;PDK1蛋白水平稳定敲除后，称量心脏重量和体重，计算心脏重量指数(HW/BW);光镜下观察心脏的整体外观变化;组织切片观察心脏形态变化，超声心动图检测评估小鼠心脏功能变化。取PDK1基因KO和WT小鼠各三个心脏组织混合样本，送公司做ArraystarLncRNA芯片，通过生物信息学分析，筛选出可能跟心衰相关的LncRNA，应用RT-PCR验证筛选结果并与芯片结果比较。 结果:1）在出生第9天时，PDK1蛋白在心脏组织中稳定敲除;2）KO小鼠与WT小鼠的心脏重量指数有统计学意义;3)KO小鼠和WT小鼠的心脏外观无明显差异;4）KO小鼠和WT小鼠的心脏切片形态无明显差异;5）超声心动图检测发现KO小鼠的心脏功能也无明显变化;6）有2024个LncRNAs表达水平变化大于1.5倍;7）其中1224个LncRNAs变化上调，800个LncRNAs变化下调;8）随机验证的5个LncRNAs有统计学意义(P＜0.05)且与芯片结果一致。 结论:1）PDK1基因稳定敲除小鼠与野生型小鼠相比，心脏整体外观、心脏形态功能与WT小鼠比较均无明显差异;2) KO小鼠心脏体重指数具有统计学上显著性差异;3）虽然PDK1基因稳定敲除小鼠未发展为心衰状态，但心脏组织中LncRNA的表达水平确实发生了变化，并且部分通过RT-PCR得到了验证。 第三部分 PDK1基因敲除小鼠心衰前与心衰时心脏组织中LncRNA的对比筛选及其相关机制的研究 目的:筛选出PDK1基因敲除小鼠在心衰发展过程中的变化的LncRNA，同时探讨LncRNA在心衰发展过程中可能的作用机制。 方法:以第一、二部分芯片结果为基础，进行对比筛选，并且通过RT-PCR验证筛选出的LncRNA的表达水平变化。后通过LncRNA的靶标mRNA的GO和Pathway的生物信息学分析来探讨可能的作用机制。 结果:对比筛选的结果如下:1）在两个时间点上同时上调的有93个LncRNAs;2)在两个时间点上同时下调的有52个LncRNAs;3）先在P8天上调后在P40天下调的有136个LncRNAs;4）先在P8天下调后在P40天上调的有51个LncRNAs;5）随机验证了8个LncRNAs均有统计学差异(P＜0.05)且与芯片结果一致。 生物信息学分析的结果如下:1）在P8天，有9个与心脏功能相关的信号通路发生了变化，其中包括MAPKsignaling、 Cell adhesion molecules和Calcium signaling pathway(P＜0.05);2）在P40天，有10个影响心脏功能的信号通路发生了变化，其中包括MAPK和Cell adhesionmolecules Pathway(P＜0.05);3)筛选发现一条顺义重叠的LncRNA(mkk7)，分析发现可能通过MAPK信号通路参与心衰的病理过程。 结论:1）PDK1基因敲除小鼠在两个时间点上即心衰发生前后，LncRNA表达水平发生多种情况的变化，推测可能参与了心衰的发生发展;2）在心衰的发生发展的过程中，LncRNA的靶标mRNA参与的信号通路发生变化;3) mkk7可能通过MAPK信号通路参与心衰的发生发展。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 PDK1基因敲除小鼠心衰时心脏组织中LncRNA的筛选

材料与方法

结果

讨论

第二部分 PDK1基因稳定敲除小鼠心衰前心脏组织中LncRNA的筛选

材料与方法

结果

讨论

第三部分 PDK1基因敲除小鼠心衰前与心衰时心脏组织中LncRNA的对比筛选及LncRNA可能的作用机制探讨

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

研究创新点

缩略语

综述 长链非编码RNA(LncRNA)与心脏相关疾病的研究进展

附录

致谢