重度子痫前期胎盘外泌体影响滋养细胞及内皮细胞功能的初步研究

摘要

目的：
　　子痫前期(Pre-eclampsia，PE)是妊娠期特有的并发症。表现在妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿及全身多器官功能损害。胎盘子宫螺旋小动脉重塑不足是PE的重要病理改变，此与绒毛外滋养细胞功能有密切关系;而全身血管痉挛造成的高血压则与血管内皮损伤及功能紊乱相关。近年，Redman提出PE发病的两阶段理论，即第一阶段在子宫胎盘局部，第二阶段全身症状出现。研究PE子宫胎盘局部变化引起全身血管病生理变化的过程成为热点。外泌体是稳定存在于细胞外的一种微型囊泡，可将miRNA、mRNA、蛋白质等生物活性分子包裹在内，运送到靶细胞从而影响靶细胞生物学功能。近来研究发现，胎盘可分泌外泌体到母体循环，调控母体全身器官的功能改变，以适应妊娠的需求，如若这一过程发生异常，则会导致妊娠疾病的发生。本研究通过分离PE患者和正常孕妇血清中胎盘外泌体，检测其对HTR-8/SVneo绒毛外滋养细胞炎症通路激活、增殖功能，以及对人原代脐静脉内皮细胞凋亡、血管舒缩相关因子eNOS表达的影响，探讨胎盘分泌的外泌体在PE发病中的作用。
　　方法：
　　取储存于-80℃的重度PE病人血清及同期正常孕妇血清各15例，每份样品取200μl，通过蔗糖密度梯度离心联合两次PEG6000沉淀分离胎盘外泌体，PBS重悬浮，BCA试剂盒对外泌体进行蛋白定量，Western blot分析各层CD63、CD81等外泌体标志分子及胎盘外泌体特有标记蛋白分子PLAP的表达情况，同时表达CD63、CD81、PLAP的密度层即可认为是胎盘外泌体所在密度层。PKH67染色胎盘外泌体后分别与HTR-8/SVneo细胞和HUVEC细胞共孵育6h，荧光显微镜观察HTR-8/SVneo细胞和HUVEC细胞对外泌体的摄入情况。采用CCK-8试剂检测重度PE患者血清及同期正常孕妇血清分离的胎盘外泌体对HTR-8/SVneo细胞增殖的影响，通过Western blot和qPCR检测PE胎盘外泌体对HTR-8/SVneo细胞NF-κB p65炎症信号通路关键分子(P-P65、MyD88、IL-6)表达的影响。利用Cell Death Detection ELISAPLUS试剂检测PE胎盘外泌体对HUVEC细胞凋亡情况。运用Western blot方法检测PE胎盘外泌体对HUVEC细胞内皮型一氧化氮合酶eNOS表达的影响。
　　结果：
　　1.蔗糖密度梯度离心后，Western blot发现CD63、CD81、PLAP同时表达于21％～34％密度层，证明血清胎盘外泌体主要存在于1.08～1.11g/mL。
　　2.CCK-8检测HTR-8/SVneo细胞增殖情况，结果显示，与正常对照组相比，重度PE病人血清胎盘外泌体明显抑制HTR-8/SVneo绒毛外滋养细胞增殖（OD450nm值分别为1.09±0.21和0.86±0.21，P＜0.05）。Western blot结果显示重度PE病人血清胎盘外泌体抑制了HTR-8/SVneo绒毛外滋养细胞增殖相关分子CCND1的表达，且促进了NF-κB p65炎症信号通路相关分子(P-P65、MyD88)表达，并提高了IL-6 mRNA水平。
　　3.Cell Death Detection ELISAPLUs检测结果表明重度PE病人血清胎盘外泌体促进了HUVEC细胞凋亡（与正常组的相对值分别为1.00±0.04，1.15±0.13，P=0.026）;Westernblot检测结果显示PE病人血清胎盘外泌体显著抑制eNOS表达。
　　结论：
　　妊娠妇女血清中存在胎盘分泌的外泌体，而PE病人血清中胎盘外泌体明显抑制HTR-8/SVneo滋养细胞增殖，激活NF-κB p65炎症信号通路，引起妊娠过程中滋养细胞增殖不足;同时促进HUVEC细胞凋亡，抑制其表达eNOS，这可能抑制血管内皮舒张功能，与PE高血压发生有关，因此，PE血清中异常存在的胎盘外泌体是炎症信号持续过度激活，PE全身症状出现并不断加重的重要病理介质。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

文献综述

第一章 胎盘外泌体的分离与鉴定

第二章 PE胎盘外泌体对滋养细胞及血管内皮细胞功能的影响

第三章 PE胎盘外泌体miR-155抑制eNOS表达

结论

主要成果与展望

致谢

参考文献

作者简介

附录