hOGG1在TNF-α诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤和凋亡中的作用

摘要

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)位于视网膜的最外层，RPE细胞对维持正常视网膜功能如吸收散射光线、视色素再生和合成、光感受器的更新和代谢以及构成血-视网膜屏障等至关重要，RPE细胞的氧化损伤和凋亡在多种视网膜变性类疾病的发病机制中起了重要作用。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)介导的炎症反应，在这些疾病的发病机制中起到了媒介作用。
　　TNF-α诱导细胞产生更多活性氧(reactive oxygen species，ROS)，在众多ROS攻击DNA产生的DNA氧化损伤中，鸟嘌呤8位碳原子的氧化最常见，形成8-羟基鸟嘌呤(8-oxoguanine，8-oxodG)，它是目前国际上公认的一种评价DNA氧化损伤的敏感指标和生物标志物。哺乳动物细胞内能够特异性修复8-oxodG的酶，被称为8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase-1，OGG1)，在人体内又称为人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(human8-oxoguanine DNA glycosylase，hOGG1)。hOGG1(OGG1)是碱基切除修复途径(base excision repair，BER)的关键酶。RPE细胞易受各种因素的攻击而产生DNA氧化损伤，这些DNA损伤若得不到及时修复，就可能会诱导RPE细胞凋亡。最近的研究表明，炎症因子TNF-α不能引起OGG1低表达的小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonal fibroblast cells，MEFs）炎症反应发生，因此推测hogg1基因可能涉及到TNF-α诱导的RPE细胞氧化损伤和凋亡中的作用，我们进行了如下研究。研究分三个部分，主要内容如下:
　　第一部分构建hOGG1-1a表达不同的人视网膜色素上皮细胞ARPE-19模型:鉴定重组腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST-hogg1和阴性对照腺病毒pAd/CMV/V5-GW/lacZ，在人胚肾293A细胞中包装腺病毒，并反复扩增病毒，用空斑形成试验测定病毒滴度。pAd/CMV/V5-DEST-hogg1、pAd/CMV/V5-GW/lacZ以30∶1的感染复数(MOI)分别转染ARPE-19细胞，采用western blot比较转染重组腺病毒组pAd/CMV/V5-DEST-hogg1的ARPE-19细胞（RPE-Ad-hogg1）、转染载体pAd/CMV/V5-GW/lacZ的ARPE-19细胞(RPE-Ad-lacZ)以及未转染的ARPE-19细胞表达的hOGG1-1a，结果显示，转染重组腺病毒组ARPE-19细胞表达hOGG1明显高于未转染组及转染空腺病毒组，而未转染组及转染空腺病毒组的ARPE-19细胞表达hOGG1无明显差别。
　　第二部分观察过氧化氢(H2O2)对hOGG1-1a表达不同的ARPE-19细胞产生ROS和氧化损伤的影响:H2O2是活性氧自由基ROS家族的成员之一，可以直接损伤细胞核内的核酸引起DNA链的氧化损伤，攻击鸟嘌呤后产生8-oxodG。本研究用20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L浓度的H2O2分别作用于ARPE-19细胞2h后，发现随着H2O2浓度的增加，ARPE-19细胞的存活率呈现下降趋势;其中H2O2浓度100μmol/L时ARPE-19细胞存活率为77.80±4.513％。以100μmol/LH2O2分别作用于hOGG1表达不同的ARPE-19细胞2h后，以流式细胞仪和免疫细胞化学法分别检测细胞内ROS的生成和形成8-oxodG的阳性细胞百分数(％)，这些结果表明，H2O2和腺病毒可以引起ARPE-19细胞内生成ROS和形成8-oxodG的阳性细胞百分数(％)增加，高表达的hOGG1减少ARPE-19细胞内ROS的生成和修复氧化剂H2O2引起的氧化损伤作用。
　　第三部分观察TNF-α对hOGG1-1a表达不同的ARPE-19细胞氧化损伤和凋亡的影响:①以10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL浓度的TNF-α分别干预hOGG1表达不同的ARPE-19细胞12、24、36、48h，用MTT法检测比较这些细胞的存活率。结果显示:不同浓度的TNF-α干预ARPE-19细胞24h内，随着TNF-α干预浓度的增加和时间的延长，各组ARPE-19细胞存活率均呈下降的趋势(P＜0.05);相同浓度TNF-α分别干预各组ARPE-19细胞36h、48h后与24h相比，细胞存活率没有显著的降低趋势(P＞0.05)。在相同浓度TNF-α诱导下，高表达hOGG1的ARPE-19组细胞存活率较两对照组细胞高(P＜0.05)。以50ng/mL TNF-α分别干预hOGG1表达不同的ARPE-19细胞24h，用流式细胞仪和免疫细胞化学法分别检测细胞内产生ROS和形成8-oxodG的阳性细胞百分数(％)，这些结果表明，TNF-α和腺病毒可以诱导ARPE-19细胞内生成ROS和形成8-oxodG的阳性细胞百分数(％)增加，高表达hOGG1能够减少ARPE-19细胞内ROS的生成和修复TNF-α和腺病毒诱导的ARPE-19细胞的氧化损伤。
　　②50ng/mL TNF-α分别干预hOGG1表达不同的ARPE-19细胞24h，用AnnexinⅤ/PI流式细胞术的方法检测细胞凋亡比例，结果发现，和未受干预的ARPE-19细胞相比，TNF-α可以引起各干预组ARPE-19细胞凋亡比例的增加;进一步用荧光定量PCR的方法检测TNF-α分别干预hOGG1表达不同的各组ARPE-19细胞Fas/FasL凋亡途径相关基因FasL、caspase3、caspase8基因mRNA的转录水平，结果发现，和未受干预的ARPE-19细胞相比，各干预组细胞上述基因mRNA表达均上调。提示TNF-α可以通过Fas/FasL死亡受体途径引起ARPE-19细胞的凋亡。
　　以50ng/mL TNF-α干预hOGG1表达不同的ARPE-19细胞24h，与空腺病毒对照组(RPE-Ad-lacZ)和未转染ARPE-19细胞组相比，高表达hOGG1组ARPE-19细胞（RPE-Ad-hogg1）的凋亡比例明显降低(P＜0.05);空腺病毒对照组较未转染ARPE-19细胞组凋亡比例增高(P＜0.05)。与两对照组相比，高表达hOGG1组ARPE-19细胞（RPE-Ad-hogg1）的FasL、caspase3、caspase8基因mRNA的表达明显下调;空腺病毒对照组ARPE-19细胞(RPE-Ad-lacZ) FasL、caspase3、caspase8基因mRNA的表达明显高于未转染ARPE-19细胞组。说明hOGG1能够通过Fas/FasL死亡受体通路抑制TNF-α诱导的ARPE-19细胞凋亡。
　　综上所述，本研究表明DNA修复酶hOGG1在ARPE-19细胞的高表达可以降低氧化剂H2O2、炎症因子TNF-α诱导的细胞内ROS的产生和8-oxodG的形成，并能通过Fas/FasL死亡受体通路抑制TNF-α诱导的ARPE-19细胞凋亡。

目录

声明

摘要

符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表

绪论

第一章 文献综述 炎症因子TNF-α与视网膜疾病的相关性研究进展

第二章 hOGG1在H2O2和TNF-α诱导的ARPE-19细胞产生ROS、氧化损伤和凋亡中的作用

前言

第一节 hOGG1表达不同的人视网膜色素上皮细胞模型的建立

1．材料

2 方法

3 结果

第二节 hOGG1在H2O2诱导的ARPE-19细胞产生ROS和形成氧化损伤中的作用

1．材料

2 方法

3 结果

第三节 hOGG1在TNF-α诱导的ARPE-19细胞产生ROS、氧化损伤和凋亡中的作用

1．材料

2 方法

3．结果

讨论

结论

致谢

参考文献

作者简介