hOGG1基因在Cr(Ⅵ)诱导L-02肝细胞线粒体DNA氧化损伤中的作用

摘要

目的:
　　 在体外试验系统，初步探讨Cr(Ⅵ)诱导线粒体DNA氧化损伤情况及hOGG1基因的修复作用，为进一步阐明Cr(Ⅵ)诱导线粒体氧化损伤的机制提供线索。
　　 方法:
　　 以L-02肝细胞为受试细胞，通过MTT试验检测不同浓度Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞存活率的影响，筛选出Cr(Ⅵ)浓度高（32μmol/L）、中(8μmol/L)、低(2μmol/L)和空白对照（0μmol/L）进行后续试验，染毒时间为24h。通过多功能荧光酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)及ATP的浓度，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测hOGG1基因mRNA的表达，酶标仪检测线粒体内8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性，Western blot方法检测线粒体内8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（hOGG1蛋白）含量，分光光度计检测细胞内过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。
　　 结果:
　　 1.Cr(Ⅵ)引起L-02肝细胞存活率降低:Cr(Ⅵ)在2-256μmol/L处理浓度范围内（处理24h），能明显引起L-02肝细胞存活率的降低(P＜0.05)，处理浓度和细胞存活率之间存在明显负相关(r=-0.924，P＜0.01)。根据细胞存活率选出适当的Cr(Ⅵ)处理浓度:高(32μmol/L)、中（8μmol/L）、低(2μmol/L)和空白对照(0μmol/L)进行后续试验。
　　 2.Cr(Ⅵ)引起L-02肝细胞活性氧簇(ROS)含量增加:与对照组比较，2μmol/L Cr(Ⅵ)处理浓度组细胞内ROS平均含量无明显增加(p＞0.05)，8、32μmol/L Cr(Ⅵ)处理组细胞内ROS平均含量逐渐增加(p＜0.05)，且随着Cr(Ⅵ)处理浓度的增大，细胞内ROS平均含量随之增加，两者之间存在明显正相关（r=0.942，P＜0.01）。
　　 3.Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞能量代谢的影响:与对照组相比，2μmol/LCr(Ⅵ)低浓度组细胞内ATP浓度无变化(p＞0.05);8、32μmol/L Cr(Ⅵ)浓度组细胞内ATP浓度明显降低(P＜0.05)，且随着Cr(Ⅵ)处理浓度的增大，细胞内ATP浓度随之降低，两者之间存在明显负相关(r=-0.967，P＜0.05)。
　　 4.Cr(Ⅵ)对线粒体内8-OHdG含量的影响:与对照组相比，2μmol/L Cr(Ⅵ)低浓度组线粒体内8-OHdG平均含量无变化(p＞0.05);8、32μmol/LCr(Ⅵ)浓度组线粒体内8-OHdG平均含量明显降低(P＜0.05)，且随着Cr(Ⅵ)处理浓度的增大，线粒体内8-OHdG含量随之增加，两者之间存在明显正相关（r=0.816，P＜0.05）。
　　 5.Cr(Ⅵ)对hOGG1基因表达的影响:与对照组相比，2μmol/L处理组hOGG1基因mRNA表达水平及线粒体内hOGG1蛋白含量均明显增加(p＜0.05);8μmol/L浓度组hOGG1基因mRNA表达水平及线粒体内hOGG1蛋白含量与对照组相比无明显改变(p＞0.05)，但低于2μmol/L处理组(p＜0.05);32μmol/L浓度组两者均明显降低(P＜0.05)，且在2-32μmol/L Cr(Ⅵ)处理浓度范围内，hOGG1基因mRNA表达水平及线粒体内hOGG1蛋白含量逐渐降低。
　　 6.Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞抗氧化酶活力的影响:与对照组相比，2μmol/L浓度组细胞内SOD、CAT和GSH-PX平均活力明显增加(p＜0.01);8μmol/L浓度组细胞内SOD和CAT平均活力明显降低(p＜0.01)，细胞内GSH-PX平均活力明显升高，且高于2μmol/L浓度组(p＜0.01);32μmol/LCr(Ⅵ)浓度组细胞内SOD、CAT和GSH-PX平均活力均明显降低。
　　 结论:
　　 Cr(Ⅵ)可诱导细胞内ROS水平增加，使mtDNA受到氧化损伤，线粒体内8-OHdG含量增加，影响ATP的产生，导致细胞发生能量代谢障碍。而hOGG1基因表达水平及抗氧化酶活力(SOD、CAT和GSH-PX)的改变，影响了线粒体DNA的修复。总之，hOGG1基因在Cr(Ⅵ)诱导线粒体DNA氧化损伤中起到了重要的作用。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 受试细胞

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要试剂溶液的配制

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 试验技术路线

2．2．2 肝细胞培养

2．2．3 肝细胞生存率检测

2．2．4 细胞内活性氧(ROS)含量检测

2．2．5 细胞ATP含量检测

2．2．6 线粒体内8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量检测

2．2．7 hOGG1基因表达水平的检测

2．2．8 细胞内SOD、CAT、GSH-PX活力检测

2．2．9 统计分析

第三章 结果

3．1 Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞存活率的影响

3．2 Cr(Ⅵ)诱导L-02肝细胞ROS的产生

3．3 Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞ATP浓度的影响

3．4 Cr(Ⅵ)对线粒体内8-OHdG含量的影响

3．5 Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞hOGG1基因表达的影响

3．6 Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞抗氧化相关酶的影响

3．7 hOGG1基因表达、线粒体内8-OHdG含量、细胞内ROS含量、ATP浓度、抗氧化酶活性和细胞存活率之间的相关性

第四章 讨论

4．1 Cr(Ⅵ)所致hOGG1基因表达改变与线粒体DNA氧化损伤的关系

4．2 Cr(Ⅵ)所致线粒体DNA氧化损伤与能量代谢障碍的关系

4．3 Cr(Ⅵ)所致抗氧化酶活力改变与线粒体DNA氧化损伤的关系

第五章 结论

参考文献

综述

致谢

研究生期间的成绩