驼源单域抗体VHH用于禽流感病毒检测及治疗的研究

摘要

禽流感是由A型流感病毒引起的禽类的全身性或者呼吸系统性疾病，鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。发病情况从急性败血性死亡到无症状带毒等极其多样，并主要取决于带病体的抵抗力及其感染病毒的类型及毒力。其中部分亚型能够感染人体并在人群中传播，人体感染禽流感病毒主要表现为发热、流涕、咳嗽、咽痛，严重者腹痛、腹泻、肺出血，导致呼吸窘迫综合征心肾功能衰竭等多脏器功能衰竭而死亡。禽流感病毒的发生与流行对世界人民的健康及家禽养殖业造成了极大的威胁。因此，早期高效快速地诊断及确定有效的治疗方案被认为是禽流感防治的关键。
　　近年来，以单克隆抗体为主的快速检测及治疗性抗体药物的开发异常活跃，但是其分子大、结构复杂和价格昂贵等诸多因素限制了它在临床应用上的推广。最新研究发现，骆驼体内存在着一种天然的缺失轻链的单独重链抗体，克隆其可变区得到的单域抗体（纳米抗体）是目前所知的最小抗原结合片段。与传统的单抗相比，单域抗体分子更小，稳定性更高。因此，获得具有特异性识别禽流感表面蛋白及中和性的单域抗体对于禽流感防治具有非常重要的意义。
　　本研究用灭活的禽流感病毒免疫新疆双峰驼，构建了针对于H1N1、H3N2、H5N1、H7N2四种亚型禽流感的四个噬菌体展示单域抗体文库。通过噬菌体展示技术进行抗体筛选，针对每种亚型的禽流感病毒，均获得三株以上的特异性单域抗体。经鉴定，获得的单域抗体特异性强、稳定性好、纯度高、产量高。随后建立了基于链霉亲和素-生物素系统的定向双抗夹心检测体系，使用该方法检测禽流感病毒的检测限均达到纳克级，且稳定性好、操作简单快速，优于市场已有的检测试剂盒，为早期诊断提供了可靠的依据和技术保证。最后，通过中和实验筛选出两株H1N1单域抗体能够有效阻断H1N1禽流感病毒对MDCK细胞的攻击，为进一步研发禽流感中和抗体药物奠定了良好的基础。

目录

声明

摘要

绪言

第一章 文献综述

1．1 禽流感的研究进展

1．2 抗体在禽流感检测及治疗中的研究进展

第二章 噬菌体展示禽流感单域抗体文库的构建

前言

2．1 实验材料和方法

2．2 实验结果

2．3 结果讨论

第三章 禽流感单域抗体的筛选、表达及鉴定

前言

3．1 实验材料和方法

3．2 实验结果

3．3 结果讨论

第四章 定向双抗夹心检测方法的建立

前言

4．1 实验材料和方法

4．2 实验结果

4．3 结果讨论

第五章 H1N1中和抗体的筛选

前言

5．1 实验材料和方法

5．2 实验结果

5．3 结果讨论

第六章 结论

6．1 结论

6．2 展望

致谢

参考文献

作者简介