希瓦氏菌MR-1在共培养过程中胞外电子传递通路的研究

摘要

希瓦氏菌MR-1是一种非常重要的模式产电细菌，它具有胞外电子传递的功能，能够将呼吸链产生的电子传递到环境中的固态铁等电子受体上，因此这种细菌在微生物燃料电池体系中得到了广泛的应用。人们对希瓦氏菌MR-1的产电代谢通路已经做了很多研究，目前主流认为有两条主要的代谢路径:在铁氧代谢中，CymA将电子通过延胡索酸还原酶FccA传递给金属还原蛋白MtrA，或者将电子直接传递给MtrA，并通过MtrA、B、C一系列金属还原蛋白将电子从细胞质内通过细胞膜表面的脂质体传递到细胞外膜;而在铁硫代谢中，传递到细胞质中的电子通过PsrA、PsrB、PsrC等蛋白传递到细胞的外表面。当电子被传递到细胞的外表面之后，希瓦氏菌MR-1通过细胞色素C介导、微生物纳米导线等机制将电子进一步传递到胞外的电子受体上。
　　人们通过研究发现，一定条件下细菌的共培养可以提高微生物燃料电池装置的产电效率，因而共培养过程中的产电机制也开始为研究人员所重视。然而，共培养对希瓦氏菌MR-1代谢路径的影响还没有人做过详细研究。本论文以希瓦氏菌MR-1为研究目标，构建了双室的微生物燃料电池(MFC)体系，用相关的电化学分析方法和16sRNA基因测序等分析手段，讨论了不同培养环境下MFC装置的电化学特征的变化，研究了菌群中希瓦氏菌与其他菌的相互作用;利用real time PCR技术对MtrA、MtrB、MtrC、OmcA等与希瓦氏菌MR-1产电代谢通路有关的基因进行了相对定量分析，研究了阳极室内双菌株共培养和菌群共培养过程中希瓦氏菌产电通路的变化规律。
　　我们对每个MFC装置至少经过3个工作周期的观测和记录，绘制不同体系下MFC装置的极化曲线、循环伏安曲线（C-V曲线）、开路电压曲线、功率密度曲线等，根据获得的数据对不同体系下MFC装置的内阻、电容量、开路电压、工作功率密度、最大理论产电效率、库伦效率等电化学数据进行表征。数据证明，混合菌培养确实能够提高产电效率，优化MFC体系的电化学性能。同时，混合菌培养有助于MFC装置内阻的降低和库伦效率的提高。
　　我们在希瓦氏菌MR-1 MFC装置的阳极电极上监测到了MtrA、MtrB、MtrC、OmcA基因随着培养时间增长，表达量均有不同程度的提高，这说明这些基因与MFC装置中希瓦氏菌的电子代谢通路有关;在双菌株共培养MFC体系中，OmcA基因的相对表达量有了显著的提高，这可能是双菌培养在电子从胞外转移到电子受体的过程起到了一定作用;而在加入柠檬酸铁的菌群共培养MFC体系中，MtrA、MtrB、MtrC基因的相对表达量均有显著的提高，一方面，这说明了铁氧化物和MtrA、MtrB、MtrC基因的表达密切相关，另一方面，这说明多培养MFC体系中希瓦氏菌的电子代谢通路确实发生了变化，这些变化正向促进了希瓦氏菌在MFC体系中的电子传递，从而对混合菌株在土环境中的电子传递造成了影响。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究目的和意义

1．2 微生物燃料电池

1．2．1 微生物燃料电池的简介

1．2．2 微生物燃料电池工作原理

1．2．4 微生物燃料电池的基本结构、性能和表征

1．3 奥奈达希瓦氏菌

1．3．1 希瓦氏菌的介绍和分类

1．3．2 希瓦氏菌的生长环境

1．3．3 奥奈达希瓦氏菌(S.oneidensis MR-1)的环境意义

1．3．4 S.oneidensis MR-1的电子传递通路

1．4 微生物共培养技术

1．4．1 共培养的基本介绍

1．4．2 共培养微生物之间的生态学关系

1．4．3 微生物共培养在MFC体系中的应用

1．4．4 S.oneidensis MR-1在共培养中的应用

1．4．5 紫细菌(Roseobacters)的介绍和紫细菌在共培养中的应用

第二章 希瓦氏菌MR-1在微生物燃料电池中的表征以及电子传递通路的研究

2．1 希瓦氏菌燃料电池体系的构建

2．1．1 实验材料和实验仪器

2．1．2 希瓦氏MR-1的培养

2．1．3 希瓦氏菌生长曲线的测定

2．1．4 希瓦氏菌菌悬液的制备和保存

2．1．5 电极材料的处理

2．1．6 质子交换膜的处理

2．1．7 微生物燃料电池装置的搭建

2．2 希瓦氏菌微生物燃料电池体系电信号的表征

2．2．1 希瓦氏菌在微生物燃料电池体系中的形态学观察

2．2．2 希瓦氏菌MFC装置的极化曲线

2．2．3 希瓦氏菌燃料电池装置的C-V曲线

2．2．4 希瓦氏菌燃料电池装置的开路电压曲线和功率密度曲线

2．2．5 希瓦氏菌燃料电池体系的库伦效率

2．3 希瓦氏菌电子传递通路在微生物燃料电池体系中的研究

2．3．1 希瓦氏菌RNA的提取

2．3．2 希瓦氏菌RNA逆转录PCR实验(RT-PCR实验)

2．3．3 希瓦氏菌DNA荧光定量PCR实验(Real Time PCR)

2．3．4 希瓦氏菌MtrA、MtrB、MtrC、OmcA等基因在燃料电池中的表达情况及电子传递通路的分析

第三章 希瓦氏MR-1和紫细菌在微生物燃料电池中共培养以及电子传递通路的研究

3．1 实验内容及方法

3．1．1 紫细菌的培养

3．1．2 燃料电池体系的构建

3．1．3 共培养微生物燃料电池体系与希瓦氏菌微生物燃料电池体系pH变化的比较

3．1．4 共培养细菌的鉴定

3．1．5 共培养微生物燃料电池体系与希瓦氏菌燃料电池体系电信号表征的比较

3．1．6 不同形态的铁对于共培养燃料电池体系电信号表征的影响

3．1．7 共培养微生物燃料电池体系对不同形态的铁还原情况的比较

3．1．8 Real-Time PCR实验

3．2 共培养微生物燃料电池体系与希瓦氏菌微生物燃料电池体系pH变化的比较

3．2．1 pH对于共培养微生物燃料电池体系的影响

3．2．2 共培养体系pH值的变化

3．3 共培养细菌的鉴定

3．3．1 电镜观察

3．3．2 流式细胞分析

3．3．3 共培养细菌的DNA提取

3．4 共培养微生物燃料电池体系与希瓦氏菌燃料电池体系电信号表征的比较

3．4．1 极化曲线

3．4．2 C-V曲线

3．4．3 功率密度曲线和开路电压曲线

3．5 不同形态的铁对于共培养燃料电池体系电信号表征的影响

3．5．1 水铁矿的制备

3．5．2 极化曲线

3．5．3 功率密度曲线和开路电压曲线

3．6 共培养微生物燃料电池体系对不同形态的铁还原情况的比较

3．6．1 铁含量标准曲线的测定

3．6．2 不同形态的铁在共培养微生物燃料电池体系中的还原情况比较

3．7 Real-Time PCR实验

第四章 希瓦氏菌在混合菌培养环境中电子通路的研究

4．1 实验内容及方法

4．1．1 燃料电池体系的构建

4．1．2 关于混合培养微生物燃料电池体系pH的研究

4．1．3 混合培养环境成分的鉴定

4．1．4 混合培养MFC装置与希瓦氏菌MFC装置电信号表征的比较

4．1．5 铁环境对于混合培养MFC装置电信号表征的影响

4．1．6 Real-Time PCR实验

4．2 关于混合培养MFC装置pH的研究

4．2．1 pH对于混合培养MFC装置的影响

4．2．2 共培养体系pH的变化

4．3 混合培养环境的鉴定

4．3．1 DNA提取和16sRNA高通量测序

4．3．2 heatmap图谱分析

4．3．3 主成分分析

4．3．4 Venn图

4．3．5 基于群落的结构分析

4．4 混合培养微生物燃料电池体系与希瓦氏菌燃料电池体系电信号表征的比较

4．4．1 极化曲线

4．4．2 C-V曲线

4．4．3 开路电压和功率密度曲线

4．5 铁环境对于混合培养MFC装置电信号表征的影响

4．5．1 极化曲线

4．5．2 开路电压和功率密度曲线

4．6 real-time PCR实验

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 展望

致谢

参考文献

作者简介