蚯蚓提取物干预矽尘诱导的小鼠肺纤维化研究

摘要

尘肺病是由于长期吸入生产性粉尘引起的以肺组织不可逆性进行性纤维化为主的全身性疾病。当前尘肺病仍是我国影响面最广泛、最严重的职业病。我国每年新诊断职业病中85％以上为尘肺病，尘肺病中绝大多数属于煤工尘肺和矽肺，占尘肺病的90％以上。煤工尘肺包括煤肺、矽肺和煤矽肺，其发病机制与矽肺基本相同，均与煤尘/矽尘中游离二氧化硅含量密切相关。目前大容量肺灌洗术对清除肺内粉尘很有效，适合早期病人，但是患者不易接受，难以推广。患者比较容易接受药物治疗，但针对尘肺病肺纤维化的特效药物很少。我国已经诊断的尘肺病人已超过70万，而且每年新增1.5万左右的新病例，这类疾病的治疗是现阶段亟待解决的问题。
　　蚯蚓也称地龙，为常见的一种陆生环节动物，生活在土壤中。其体内含有丰富蛋白质、矿物质及脂肪酸。蚯蚓是我国重要的中药材之一，最早的中药学专著《神农本草经》中收载的67种动物药中就有蚯蚓，用于治疗多种疾病。1995年国家卫生部批准了蚯蚓提取物的生产，在治疗心脑血管疾病上得到了非常广泛的应用。蚯蚓提取物中主要的功效性成分为蚓激酶和纤溶酶。动物实验和临床观察均证明，蚯蚓提取物有着很多药理学功能，例如纤溶，抗凝，抗炎以及抗氧化等。理论上这些功能是能够抑制矽尘诱导的肺部早期炎症反应及后期的纤维化，目前未见相关报道。因此，我们构建矽尘诱导的肺纤维化动物模型，用蚯蚓提取物早期干预和治疗矽肺，通过观察病理学、肺纤维化标志物及μ CT等判定其干预和治疗效果，为开发有效的预防/治疗矽肺肺纤维化药物提供科学依据，也为扩大蚯蚓提取物的治疗领域提供新的线索。
　　目的:通过建立矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型，设立蚯蚓提取物预防、早期治疗和纤维化成熟期治疗三种实验方案，来探讨蚯蚓提取物是否能预防/治疗矽尘诱导的肺纤维化，为开发有效的预防/治疗矽肺病药物提供科学依据。
　　方法:(1)设计蚯蚓提取物预防、早期治疗和纤维化成熟期治疗矽肺三种实验方案;①预防方案:小鼠随机分为4组，对照组、矽尘组、蚯蚓提取物低剂量组和高剂量组。高、低剂量组分别腹腔给予纯化蚯蚓提取物（酶活性单位分别为24U/g和240U/g），每天1次，共5天。然后经气管一次性滴注SiO2粉尘悬液，第2天继续腹腔给予蚯蚓提取物，对照组和矽尘组给予生理盐水，连续给药至不同时间终点（7天、14天、28天）;②纤维化早期治疗方案:分组同前，另外加入吡非尼酮治疗组。除对照组外，其余各组均行气管一次性滴注SiO2粉尘悬液，对照组气管滴注生理盐水;第4周开始给药治疗，治疗5周观察疗效。③纤维化成熟期治疗方案:分组同前，矽尘处理第5周开始给药治疗，治疗4周观察疗效。(2)通过小鼠BALF细胞计数、病理切片HE染色、纤维化评分以及肺脏μCT来观察SiO2粉尘诱导小鼠矽肺发生发展的动态变化过程;(3)通过Masson染色、免疫组化和WB等实验技术检测胶原纤维、α-SMA、E-cad、TGF-β1、Smad2等纤维化标志物的动态表达情况;应用ICP-MS检测小鼠血清中硅含量变化趋势。
　　结果:
　　1蚯蚓提取物预防矽尘诱导的小鼠肺纤维化
　　(1) BALF细胞计数:BALF中细胞总数、巨噬细胞及中性粒细胞数量变化趋势基本一致，矽尘能显著增加肺泡内上述细胞数量，但随着处理时间的增加细胞数呈下降趋势，蚯蚓提取物在一定程度上能抑制矽尘导致的炎症细胞渗出，其BALF中细胞数量高于对照组而低于矽尘组。矽尘处理初期，蚯蚓提取物能增加BALF中淋巴细胞的数量，以高剂量组BALF中淋巴细胞数量最多，随时间逐渐降低，在28天淋巴细胞数量低于矽尘组，高于对照组。同样说明蚯蚓提取物能抑制矽尘诱导的肺泡内炎症细胞渗出。
　　(2)病理切片HE染色显示及纤维化评分:染尘后7天、14天、28天分别处理小鼠，与肺纤维化发生发展过程较为典型的矽尘组相比，蚯蚓提取物处理组高、低剂量组变化趋势基本一致，肺泡炎症及肺纤维化程度均较模型组明显减轻，干预7天组肺组织炎细胞浸润区域较模型组明显减少。干预14天组肺组织结构较模型组完整，成纤维细胞增殖减轻，细胞聚集范围减小，病变程度较同期模型组轻。干预28天组虽出现细胞性结节，但大小及数量均较同期模型组少。纤维化评分从量化指标上进一步证实了蚯蚓提取物能明显抑制矽尘诱导的纤维化发生发展。
　　(3)μCT:处理28天后，矽尘组小鼠充气肺容积立体像素值明显低于对照组，高、低剂量蚯蚓提取物治疗组小鼠充气肺容积立体像素值略高于矽尘组，尤其是低剂量组与矽尘组比较有统计学意义。提示矽尘导致肺内含气量减少可部分被蚯蚓提取物抑制。
　　(4)纤维化标志物:Masson染色显示矽尘组胶原沉积明显增多，高、低剂量蚯蚓提取物治疗组胶原沉积较少;免疫组化结果显示矽尘组的α-SMA表达水平明显增加，高、低剂量蚯蚓提取物处理组α-SMA表达水平明显降低，接近对照组，而E-cad表达水平呈现相反的变化趋势。纤维化信号通路(TGF-β)重要分子TGF-β1和Smad2在矽尘组表达明显上调，而高、低剂量蚯蚓提取物处理组则明显下调。提示蚯蚓提取物能够抑制矽尘诱导的细胞外基质的沉积、成纤维细胞的活化及上皮细胞间质转化，其机制可能是通过影响TGF-β信号通路实现的。
　　(5)血清硅含量:矽尘处理7天及14天后，与对照组相比，矽尘组和高、低剂量蚯蚓提取物治疗组血清硅含量均增加;至28天后，矽尘组和高、低剂量蚯蚓提取物治疗组血清硅含量明显增加，且高、低剂量蚯蚓提取物治疗组血清硅含量显著高于对照组。提示蚯蚓提取物能增加硅吸收入血，从而减少了肺内硅的含量。
　　2蚯蚓提取物治疗矽尘诱导的小鼠肺纤维化
　　(1)纤维化早期治疗效果:染尘后第4周开始治疗，对照组10只小鼠均未发生纤维化性病变，矽尘组纤维化严重程度评分均数为3.0，分布范围评分均数为2.3;蚯蚓提取物治疗组和吡非尼酮治疗组病变严重性及分布范围均明显减轻，与矽尘组有统计学差异，提示蚯蚓提取物作为治疗性用药的效果良好。
　　(2)纤维化成熟期治疗效果:染尘后第5周开始治疗，对照组5只小鼠均未发生纤维化性病变，矽尘组纤维化严重程度评分均数为2.8，分布范围评分均数为2.6;蚯蚓提取物治疗后病变严重程度与矽尘组比较无统计学差异（P＞0.05），仅高剂量治疗组病变分布范围明显较少，且有统计学差异（P＜0.05），提示蚯蚓提取物治疗效果主要是减少了纤维化病变分布范围。μCT分析显示与矽尘组相比，高低剂量组肺容积立体像素值增加，但无统计学差异，提示蚯蚓提取物治疗成熟期肺纤维化时，能部分增加肺容积，但幅度有限。
　　结论:(1)小鼠肺纤维化的预防模型结果提示蚯蚓提取物在矽肺的发生发展的炎症阶段及纤维化阶段均发挥抑制作用，且低剂量的给药效果优于高剂量给药。(2)纤维化早期治疗模型综合来看，蚯蚓提取物和吡非尼酮均能有效抑制纤维化发展，且蚯蚓提取物治疗效果不比吡非尼酮差。(3)肺纤维化成熟期用蚯蚓提取物治疗有一定的治疗效果，但比早期治疗效果差，且需要较高的剂量。

目录

声明

缩略语

摘要

前言

材料与方法

1．主要仪器及试剂

2．实验动物来源及喂养

3．主要试剂配制

4．实验方案

5．检测方法及检测指标

6．统计分析

结果

1 蚯蚓提取物预防矽尘诱导的小鼠肺纤维化

2 蚯蚓提取物治疗小鼠矽肺的效果

讨论

结论

参考文献

综述

硕士期间发表论文

致谢