葡萄籽提取物对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响

摘要

目的:
　　肺纤维化是一种间质性肺部疾病，常由各种呼吸系统致病因素导致，它包括特发性肺纤维化，慢性阻塞性肺部疾病导致的气道肺纤维化和哮喘气道重塑。肺纤维化患者在确诊后一般仅有3-5年的存活期，并且会伴有一系列并发症。但目前对于肺纤维化的治疗及预后缺乏特效药，寻找有效治疗肺纤维化的理想药物已成为医药领域的重要研究课题。近年越来越多的研究表明，葡萄籽提取物具有较高的营养与药效价值。尤为葡萄籽提取物所含原花青素(Procyanidins)、白藜芦醇(Resveratrol)、脂类等成分具有预防治疗癌症、清除多余的自由基，保护心血管系统等作用，不失为一种来源于天然植物具有开发前景的保健品或药物。在我国，葡萄是大面积种植、食用且营养价值极其丰富的高产水果，因而葡萄籽的开发利用具有广阔的应用市场及前景，以及重大的社会学、经济学意义。
　　本研究侧重探索葡萄籽提取物对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的改善作用，并初步探讨其防治肺纤维化的作用机制。
　　方法:
　　第一部分:ICR小鼠50只随机分为5组，正常对照组，模型组，GSE50 mg/kg、GSE100mg/kg组，阳性对照(DXM0.5 mg/kg)组。实验时，小鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠(10mL/kg)，麻醉后仰位固定于试验台上，切开颈部皮肤，暴露气管，用注射器穿刺气管滴入BLM(2 mg/kg)，再缝合颈部皮肤。空白对照组用等容量的生理盐水在小鼠气管内滴注。造模第二天分别按组进行药物干预，受试品溶液按0.2 mL/20 g容量灌胃给予，正常组和模型组均给予等量溶媒，连续21天，给药过程定期记录小鼠体重。实验结束后采用Buxco动物肺功能分析系统测定小鼠肺功能。实验结束处死小鼠，结扎左肺，灌洗右肺肺泡，收集肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，取上清液计数其中的白细胞总数、检测TGF-β1与LDH;沉淀用于计数巨噬细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞分类计数。取小鼠左肺肺组织制作组织切片，行H&E染色，光学显微镜下观测肺组织形态。
　　第二部分:ICR小鼠50只随机分为5组，正常对照组，模型组，GSE50 mg/kg、GSE100mg/kg组，阳性对照(DXM0.5 mg/kg)组。小鼠腹腔内注射3％戊巴比妥钠（10 mL/kg），麻醉后仰位固定于试验台上，注射器穿刺气管滴入BLM（2 mg/kg），再缝合颈部皮肤。空白对照组以等容量的生理盐水进行气管内滴注。造模第二天分别按组进行干预，受试品溶液按0.2 mL/20 g容量灌胃给予，正常组和模型组均给予等量溶媒，持续进行21天。结束后杀死小鼠，结扎左肺，灌洗右肺肺泡，收集肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)上清液用于检测TGF-β1含量。取小鼠部分左肺肺组织制作组织切片，行Masson染色和免疫组化，在光学显微镜下进行观测。另一部分左肺用于检测羟脯氨酸(Hydroxyproline，HYP)含量，并制备组织匀浆用实时定量PCR(qRT-PCR)法检测EMT相关因子。
　　结果:
　　第一部分:与模型组相比，灌胃GSE可显著改善BLM导致的肺纤维化小鼠肺功能Penh值升高，显著减少BALF中白细胞总数，中性粒细胞和巨噬细胞的增加。下调肺组织中IL-6、IL-1βmRNA高表达，缓解BLM诱发的肺泡结构破坏与肺组织实质病变减少肺泡灌洗液中LDH含量。
　　第二部分:灌胃GSE可显著下调肺组织中MMP-9与TIMP-1 mRNA和蛋白高表达，减少BLM诱导的肺组织中的胶原纤维沉积及羟脯氨酸的水平，减少肺泡灌洗液中TGF-β1含量。GSE可通过抑制p38通路的激活调节纤维化相关因子E-cadherin、FN1与COL1A1 mRNA和蛋白表达，上调E-cadherin表达，下调FN1与COL1A1表达，从而改善肺纤维化程度。
　　结论:
　　经研究发现口服GSE不仅显著降低BLM诱导的肺部炎症细胞聚集和浸润，改善肺功能，并且能够显著抑制纤维化相关因子，如羟脯氨酸，TGF-β1，MMP-9，COL1A1和FN1的表达。GSE作为一种天然抗氧化剂，能够通过p38信号通路抑制EMT和细胞外基质的沉积，显著改善由博莱霉素导致的小鼠肺功能下降与肺组织损伤。