长白猪Gli家族锌指结构3(Gli3)的分子克隆和表达分析及GIPRdn转基因猪表型分析

摘要

本文通过以下几个部分展开论述：
　　第一部分、长白猪Gli家族锌指结构3(Gli3)的分子克隆和表达分析
　　目的:Gli家族锌指结构3(Gli3)在胚胎发育，器官形成方面有重要作用，是Hedgehog(Hh)信号通路中重要的转录因子，也是非常保守的调控因子。Gli3基因突变，引起多种综合征，以及器官畸形。作为大动物长白猪中的Gli3基因在Genbank中只有几个外显子，没有完成的基因序列。本实验旨在通过已知几个外显子，克隆出全长的Gli3基因。
　　方法:(1)提取长白猪肺组织的RNA，逆转录合成cDNA;(2)通过已知外显子和基因同源性设计Gli3基因引物，克隆Gli3基因中后段序列，利用RACE技术克隆Gli3基因两端序列，即可得到Gli3的全长序列;(3)生物信息学预测Gli3基因的开放阅读框，Gli3蛋白的生化特征，N-糖基化，磷酸化位点，二级结构，模拟三级空间结构，生物进化树;(4)实时定量PCR检测Gli3基因在长白猪胎儿110天和成年猪中的心、肝、脾、肺、肾、脑、皮、肌肉、舌等器官和组织中的基因相对表达水平。
　　结果:获得长白猪Gli3基因全长序列6289个碱基，完整的阅读框，其中包括从292到5052共4761碱基编码序列，291个碱基为5'端非编码区，1237个碱基为3'端末端非编码区。长白猪Gli3基因共编码1587个氨基酸。生物信息学分析蛋白分子量约为169kDa，等电点约为7.2，没有预测到N端的信号肽，无跨膜结构，没有O连接糖基化位点，有6个N连接糖基化位点，预测到Gli3蛋白有大量磷酸化位点。Gli3蛋白有4个锌指结构的保守结构。无规则卷曲在Gli3蛋白二级结构中占主要地位。实时定量PCR检测Gli3基因结果显示在长白猪胎儿和成年长白猪的脾，肺，肾，脑均有高表达。
　　结论:通过RT-PCR和RACE技术成功克隆出长白猪Gli3基因全长序列。为长白猪中Gli3基因的研究提供了分子基础。
　　第二部分、GIPR血转基因猪表型分析
　　目的:通过克隆方法建立的GIPR过表达显性抑制的转基因猪模型，研究GIP在糖代谢稳态中的作用。
　　方法:对2月龄和5月龄的GIPRdn转基因和野生型长白猪进行口服葡萄糖耐量测试，分析血糖和胰岛素含量。糖耐量测试结束，分离猪的胰腺，称重，免疫组化方法分析GIPRdn转基因和野生型长白猪胰腺中Ki67和Insulin的表达水平。
　　结果:GIPRdn转基因猪2月龄口服糖耐量测试1h后，血糖明显高于对照组，1.5h后胰岛素含量也明显比对照组高，证明GIPRdn转基因猪糖耐量确实受到损害;5月龄口服葡萄糖1.5h后，血糖也明显低于对照组，而胰岛素仅仅0.5h后就明显高于对照组，确认GIPRdn转基因猪糖耐量依然受到损害。GIPRdn转基因猪从2月龄到5月龄表现出糖耐量受损基本没有变化，而胰岛素分泌明显减少。GIPR血转基因猪胰腺重量明显减轻。免疫组织化学显示insulin明显降低，胰腺细胞增殖明显减少。
　　结论:过表达显性抑制的GIPRdn转基因猪从2月龄到5月龄表现出糖耐量受损和胰岛素分泌障碍，证明GIPRdn转基因猪是研究糖尿病的很好模型。

目录

声明

第一部分、长白猪Gli家族锌指结构3(Gli3)的分子克隆和表达分析

摘要

前言

材料与方法

结果

结论

讨论

参考文献

英文缩略词(Abbreviations and acronyms)

第二部分、GIPRdn转基因猪表型分析

摘要

前言

材料与方法

结果

结论

讨论

参考文献

英文缩略词(Abbreviations and acronyms)

文献综述 糖尿病动物模型研究进展

攻读硕士学位期间发表文章

致谢