基于PepT1/ER靶向的纳米胶束给药系统：设计、合成及生物活性研究

摘要

肽转运蛋白1(PepT1)和雌激素受体(ER)在部分肿瘤组织高度表达，其与肿瘤的发生、发展有着密切的关系，本课题组前期研究发现PepT1对L-缬氨酸-L-缬氨酸(L-Val-L-Val)二肽前药能够特异性识别、吸收;而雷洛昔芬对ER具有高亲和力且具有拮抗活性。基于此，本论文尝试在两亲性聚合物的亲水端分别引入L-Val-L-Val二肽片段和雷洛昔芬结构片段，然后通过大分子伯胺化合物引发氨基酸（丙氨酸或组氨酸）的N-羧基-α-氨基酸-环内酸酐(NCA)的开环聚合反应，设计合成了分别基于PepT1和ER靶向的聚乙二醇-聚氨基酸两个系列的嵌段聚合物，并经IR和1H NMR表征确定其结构。进一步利用透析法制备成胶束，再负载上肿瘤药阿霉素(DOX)，得到PepT1和ER靶向的纳米胶束给药系统，并对其理化、外观形态及生物活性进行了研究。
　　本文设计合成了4个基于PepT1受体靶向的聚合物，通过DLS检测其粒径均在200nm以内，透射电子显微镜(TEM)观察其均为圆球状。应用紫外测定了载药胶束的载药量和包封率，4个聚合物胶束均可以有效地负载阿霉素(DOX)。其中聚合物L-Val-L-Val-PEG-PHis的载药率高达8.5％，包封率为89.5％。且由于疏水端引入了酸敏感的聚组氨酸嵌段，在pH5.5的条件下，24h后DOX的释放量能达到85％，明显高于正常生理条件下的40％，表现出对酸性环境敏感的特性。在体外抗肿瘤实验中，4个载药胶束对人肝癌细胞株(HepG2)、人胃癌细胞株(SGC7901)、人乳腺癌细胞(MCF-7)均表现出与游离DOX相当的活性。本文进一步研究了聚合物胶束对靶细胞人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2)细胞的细胞毒性，实验结果表明，聚合物胶束本身对细胞基本无毒性，负载上DOX之后表现出和游离DOX相当的毒性。体外细胞摄取实验发现，聚合物胶束的细胞摄取量明显高于游离的DOX，且靶药L-Val-L-Val-PEG-PAla-DOX和L-Val-L-Val-PEG-PHis-DOX的细胞摄取量也明显高于非靶药Ac-PEG-PAla-DOX和Ac-PEG-PHis-DOX，竞争性实验进一步证明了PepT1的靶向作用。
　　本文还设计合成了4个基于ER受体靶向的聚合物，同样分别利用DLS和TEM证实了其纳米结构，并检测其粒径分布(＜200nm)和形态（圆球状）。紫外测试发现，4个聚合物均能有效的对DOX进行负载，其中聚合物Rlx-PEG4000-PHis的载药率高达9.07％，包封率高达91.43％，负载效果十分良好。体外细胞毒性实验表明，聚合物材料对SGC7901、MCF-7、人非小细胞肺癌(A549)和人正常细胞(LO2)均无毒性，聚合物材料本身安全无毒，对正常组织毒副作用小。负载上DOX之后，4个聚合物载药胶束对SGC7901、A549和MCF-7细胞均表现出与游离DOX相当的细胞毒性，具有进一步研究的良好前景。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 纳米药物传递系统(nano drug delivery system)

1．2 纳米胶束给药系统的靶向性

1．2．1 被动靶向

1．2．2 主动靶向

1．3 纳米胶束给药系统的构成与制备

1．3．1 胶束的形成机理

1．3．2 载药胶束的制备方法

1．3．3 聚合物胶束的优、缺点

1．4 刺激响应型聚合物胶束

1．4．1 pH响应型聚合物

1．4．2 温度响应型聚合物

1．4．3 磁响应型

1．5 选题依据与目的

1．5．1 PepT1受体

1．5．2 雌激素受体(Estrogen receptor，ER)

第二章 PepT1靶向的纳米胶束给药系统的设计、合成及生物活性研究

2．1 实验试剂及仪器

2．2 载药材料的设计思路

2．3 L-Val-L-Val-PEG-PAla及L-Val-L-Val-PEG-PHis的合成

2．3．1 Boc-L-Val-L-Val-OH的合成

2．3．2 PEG的官能团转换

2．3．3 PEG的PepT1靶向修饰

2．3．4 NCA的合成

2．3．5 聚合物L-Val-L-Val-PEG-PAla、L-Val-L-Val-PEG-PHis的合成

2．3．6 聚合物Ac-PEG-PAla、Ac-PEG-PHis的合成

2．4 结果与讨论

2．4．1 PEG的官能团转换和结构修饰

2．4．2 NCA的合成

2．4．3 聚合物L-Val-L-Val-PEG-PAla、L-Val-L-Val-PEG-PHis及Ac-PEG-PAla、Ac-PEG-PHis的合成

2．5 胶束的制备及性能测试

2．5．1 实验材料

2．5．2 空白胶束的制备

2．5．3 载药胶束的制备

2．5．4 胶束的粒径分布、Zeta电位以及形态学观察

2．5．5 载药胶束的载药量和包封率测试

2．5．6 载药胶束的体外药物释放

2．6 实验结果与讨论

2．6．1 胶束的粒径、形貌以及电位测试

2．6．2 载药胶束的载药量、包封率及体外药物控制释放性能

2．6．3 载药胶束的体外细胞毒性

2．6．4 载药胶束的体外细胞摄取

2．7 本章小结

第三章 ER靶向的纳米胶束给药系统的设计、合成及生物活性研究

3．1 实验试剂及仪器

3．2 载药材料的设计思路

3．3 Rlx-PEG2000-OH的合成路线和合成方法

3．3．1 PEG2000的选择性保护

3．3．2 连接子的链接

3．3．3 靶向基团雷洛昔芬的修饰

3．3．5 Rlx-PEG4000-PLA的合成

3．4 Rlx-PEG4000-PAla和Rlx-PEG4000-PHis的合成

3．4．1 靶向基团雷洛昔芬的修饰

3．4．2 开环聚合物反应以及保护基的脱去

3．5 结果与讨论

3．5．1 Rlx-PEG2000-OH的合成

3．5．2 Rlx-PEG4000-PLA的合成

3．5．3 Rlx-PEG4000-PAla和Rlx-PEG4000-PHis的合成

3．6 胶束的制备及生物活性测试

3．6．1 胶束的粒径、形貌以及电位测试

3．6．2 载药胶束的载药量和包封率测试

3．6．3 载药胶束的体外细胞毒性

3．8 本章小结

参考文献

第四章 全文总结

致谢

作者攻读硕士期间发表论文

附录