Cif效应蛋白通过靶向Cullin-RING泛素连接酶抑制肠癌细胞增殖的研究

摘要

目的:研究表明致病性大肠杆菌相关毒力因子Cif（cycle inhibiting factor）可能会影响肿瘤的发生发展，本实验从不同技术角度探索Cif效应蛋白对人结肠癌细胞株SW620及HCT116细胞生物学行为的影响，并进一步探讨其可能的机制。
　　方法:利用四环素诱导表达系统(Tet-on系统)构建可分别诱导野生型Cif(HA-cifWT)和突变型Cif（HA-cifC/A）效应蛋白表达的重组载体（HA为检测标签;HA-cifC/A中的突变点指由野生型的第109位半胱氨酸变成丙氨酸，该突变能够消除Cif效应蛋白的脱氨酶效应）。选用人结肠癌细胞株为模型，建立由Tet-on系统分别调控HA-cifWT和HA-cifC/A效应蛋白表达的肠癌稳定细胞系;同时建立空载体稳定细胞系作为空白对照。稳定细胞株经过强力霉素（Dox，四环素类抗生素）诱导后，利用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测Cif效应蛋白表达情况。通过克隆形成实验、四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验分析表达Cif效应蛋白对肠癌细胞增殖能力和活性的影响。以GFPdgn绿色荧光蛋白作为指示系统，通过荧光显微镜分析各组GFPdgn蛋白的表达水平，以评价Cif效应蛋白抑制肿瘤细胞Cullin-RING泛素连接酶(Cullin-RING Ligase，CRL)活性的效果。利用Western blot分析肿瘤细胞内参与调节DNA复制/损伤、细胞周期进展、细胞凋亡和衰老等的关键CRL底物的积聚情况。
　　结果:Western blot鉴定已成功建立了可分别诱导表达野生型Cif(HA-cifWT)和突变型Cif(HA-cifC/A)效应蛋白的结肠癌细胞稳定株HCT116/SW620-HA-cifWT和HCT116/SW620-HA-cifC/A，同时建立空白对照HCT116/SW620-NC。克隆形成实验及MTT实验结果证实，HCT116/SW620-HA-cifWT组肠癌细胞增殖能力及细胞活性显著低于HCT116/SW620-HA-cifC/A组及NC组(p＜0.05）。荧光显微镜结果显示GFPdgn蛋白在细胞株HCT116/SW620-HA-cifWT中高表达，而在HCT116/SW620-HA-cifC/A及HCT116/SW620-NC组中低表达。Western blot实验发现野生型Cif效应蛋白可促进肠癌细胞内CRL底物p21、p27蛋白的积聚。
　　结论:以上结果表明Cif效应蛋白可特异性抑制肠癌细胞内CRL的活性，从而阻断其底物如p21、p27蛋白的泛素化降解，最终达到抑制肠癌细胞增殖的目的。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 文献综述 Cullin-RING E3泛素连接酶及其抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展

第二章 材料和方法

第三章 结果

第四章 讨论

结论

参考文献

发表论文

作者简介

致谢

附录