以GRP78蛋白为靶向的胰蛋白酶抑制剂抗肠癌效应研究

摘要

葡萄糖调节蛋白78（GRP78）存在于内质网中，主要起分子伴侣的作用，在正常细胞中帮助蛋白质正确折叠与装配，同时，参与调节错误折叠蛋白的降解，内质网中Ca2+离子的结合和内质网应激信号活化。实体肿瘤通常处于低氧、低葡萄糖和PH酸性的微环境中，这些微环境因素可以通过内质网应激反应促进GRP78蛋白在肿瘤细胞中的表达。最新研究表明，GRP78在肿瘤细胞中可以转移到细胞表面，而在正常细胞的膜表面却没有观察到这种转移。所以，肿瘤细胞膜表面特有的GRP78蛋白就可以成为治疗肿瘤细胞特异的的分子靶点。
　　 我们前期研究发现，绿豆胰蛋白酶抑制剂赖氨酸活性片段mTI能够抑制大肠癌细胞SW480细胞的迁移，但对大肠癌细胞的增殖和存活却没有显著的影响。为了增强mTI的抗肿瘤效果和靶向性，本研究将GRP78结合肽WIFPWIQL与mTI蛋白通过基因工程手段构建成为融合蛋白GBP-TI，并从细胞和动物实验水平研究GBP-TI的靶向抗肿瘤作用。
　　 首先，以mTI表达质粒为模板，用含有WIFPWIQL表达序列的引物通过PCR扩增目的序列;构建GBP-TI蛋白的原核表达载体，IPTG诱导GBP-TI蛋白的表达;GST亲和柱纯化获得高纯度的GBP-TI蛋白。胰蛋白酶抑制剂活性检测结果表明，GBP-TI具有与mTI相当的胰蛋白酶抑制活性。免疫细胞化学染色表明，GBP-TI与大肠癌细胞表面GRP78存在共定位关系，表明GBP-TI能够特异性靶向GRP78蛋白。
　　 然后，通过MTT法，流式细胞术和JC-1试剂盒对细胞的增殖活力，细胞周期和线粒体膜电位进行检测，同时，利用DAPI染色技术和Westernblot手段对细胞的凋亡小体和增殖、凋亡相关信号蛋白的影响和变化进行检测。实验结果发现，GBP-TI能够特异性的诱导G0/G1期阻滞，抑制大肠癌细胞增殖，其分子机制是通过抑制β-catenin介导的cyclinD1表达。GBP-TI还能够特异性诱导Bax/Bcl-2表达比例提高进而降低线粒体膜电位，活化线粒体凋亡途径，并激活内质网应激途径和死亡受体凋亡途径，从而特异性诱导大肠癌细胞凋亡。值得一提的是，GBP-TI对正常细胞的增殖和存活无明显影响，表现出它具有良好的抗肿瘤靶向性。
　　 进一步采用裸鼠成瘤实验从体内水平（invivo）评价GBP-TI的抗肿瘤效应，结果表明GBP-TI能够明显的抑制肿瘤的生长，组织样本分析显示GBP-TI能够降低细胞增殖、存活相关蛋白cyclinD1、β-catenin、Bcl-2和Ki67的表达，而提高凋亡蛋白相关蛋白CHOP、caspase-3、Bax等蛋白的表达量，裸鼠的体内实验结果与细胞体外水平结果相一致。
　　 综上所述，本研究采用基因工程的方法构建了基于绿豆胰蛋白酶抑制剂、以细胞表面GRP78蛋白为靶点的重组靶向抗肿瘤活性分子GBP-TI。通过体内和体外实验证明重组GBP-TI能够特异、高效的诱导肿瘤细胞凋亡，但对正常组织、细胞生长影响不明显，表现出其对肿瘤细胞的特异靶向性。本研究数据为多肽类肿瘤靶向药物的开发提供了一种新的实现策略，具有重要的理论意义和应用价值。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 分子靶向药物的研究与开发

1．1．1 靶向核酸的抗肿瘤药物

1．1．2 靶向蛋白、信号受体和微管的抗肿瘤药物

1．1．3 靶向药物的临床应用

1．2 GRP78—肿瘤靶向治疗的新靶点

1．2．1 GRP78的结构

1．2．2 GRP78蛋白的功能

1．3 胰蛋白酶抑制剂的抗肿瘤作用

1．3．1 蛋白酶抑制剂的分类

1．3．2 蛋白酶抑制剂的抗肿瘤作用

1．4 本研究的目的与意义

第二章 靶向胰蛋白酶抑制剂的表达与纯化

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 菌株与质粒

2．1．3 试剂

2．2 实验方法

2．2．1 大肠杆菌DH5α/BL21感受态细胞制备

2．2．2 GBP-TI表达载体的构建

2．2．3 胰蛋白酶抑制剂GBP-TI的诱导表达

2．2．4 胰蛋白酶抑制剂GBP-TI的纯化

2．2．5 胰蛋白酶抑制剂GBP-TI的活力测定

2．3 实验结果

2．3．1 胰蛋白酶抑制剂GBP-TI的诱导表达与纯化

2．3．2 胰蛋白酶抑制剂GBP-TI的活性

2．4 讨论

第三章 靶向胰蛋白酶抑制剂的抗肿瘤效应研究

3．1 实验材料

3．1．1 实验仪器

3．1．2 细胞株

3．1．3 试剂

3．2 实验方法

3．2．1 细胞的冻存及复苏

3．2．2 细胞的培养

3．2．3 激光共聚焦检测GBP-TI与细胞表面GRP78相互作用

3．2．4 MTT法检测GBP-TI对细胞存活的影响

3．2．5 流式细胞技术检测GBP-TI对细胞周期的影响

3．2．6 Western blotting检测GBP-TI对细胞周期蛋白的影响

3．2．7 DAPI染色观察GBP-TI对结肠癌细胞细胞核的影响

3．2．8 统计学处理

3．3 实验结果

3．3．1 激光共聚焦检测GBP-TI与细胞表面GRP78相互作用

3．3．2 GBP-TI抑制结肠癌肿瘤细胞的生长

3．3．4 GBP-TI诱导结肠癌细胞凋亡

3．4 讨论

第四章 靶向胰蛋白酶抑制剂诱导肠癌细胞凋亡的分子机制研究

4．1 实验材料

4．1．1 实验仪器

4．1．2 细胞株

4．1．3 抗体及试剂

4．2 实验方法

4．2．1 流式细胞技术检测GBP-TI对线粒体膜电位的影响

4．2．2 Western blotting检测GBP-TI影响细胞凋亡相关蛋白

4．2．3 统计学处理

4．3 实验结果

4．3．1 GBP-TI诱导大肠癌细胞线粒体膜电位降低

4．3．2 GBP-TI秀导Bax/Bc1-2蛋白比例升高

4．3．3 GBP-TI激活内质网应激途径和死亡受体途径

4．4 讨论

第五章 靶向胰蛋白酶抑制剂对大肠癌肿瘤生长影响的体内试验研究

5．1 实验材料

5．1．1 实验仪器

5．1．2 实验动物及细胞株

5．1．3 抗体及试剂

5．2 实验方法

5．2．1 细胞培养

5．2．2 裸鼠人肠癌(DLD1)移植模型的建立

5．2．3 模型分组及给药

5．2．4 瘤体积的称重

5．2．5 Western blotting检测GBP-TI影响细胞凋亡相关蛋白

5．2．6 免疫组织化学染色

5．2．7 统计学处理

5．3 实验结果

5．3．1 GBP-TI对肿瘤体积及重量的影响

5．3．2 GBP-TI对肿瘤组织中增殖、凋亡相关蛋白表达的影响

5．4 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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