一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、及其应用、大量制备豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、及其应用、大量制备豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。如上所述本发明的发明人首先利用PCR反应从豇豆基因组DNA中直接获得CPTI基因(CPTI基因不含有内含子)，然后优化改造所述CPTI序列，改造后的序列在大肠杆菌中的表达量和表达比活性都有显著改进。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、及其应用、大量制备豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。

背景技术

豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor，CPTI)是一种属于Bowman-Birk家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以与农业害虫(主要是鳞翅目、直翅目、鞘翅目昆虫)消化道中的丝氨酸蛋白酶形成酶-抑制剂的复合物，从而减弱或阻断蛋白酶的消化水解作用，进而使害虫产生营养不良，出现机能紊乱甚至死亡现象。与传统的Bt蛋白相比，CPTI蛋白具有抑虫或杀虫谱更广、对人畜安全等优点，是一种生物农药的潜在开发对象，因而在农林业具有很高的应用和推广价值。

大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的原核表达体系，主要由表达载体和宿主菌两部分组成。表达载体一般具有以下特征：稳定的遗传复制、传代能力；具有筛选标记；可调控的启动子，抑制时本底转录水平较低；具备外源基因插入的多克隆位点。宿主菌一般选择蛋白酶缺陷的菌株，如经典的BL21系列菌株就是lon和ompT蛋白酶缺陷型。

但是并非所有外源基因在大肠杆菌表达系统中都能高效表达，本发明的发明人发现从豇豆中克隆得到的豇豆胰蛋白酶抑制剂不能在大肠杆菌中高效表达，其表达量较低，表达的蛋白活性较低。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因。

本发明的再一目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂。

本发明的另一目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂原核表达载体。

本发明的另一目的是提供一种高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。

本发明的另一目的是提供一种高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的基因工程菌株。

本发明的另一目的是提供上述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的应用。

如上所述本发明的发明人首先利用PCR反应从豇豆基因组DNA中直接获得CPTI基因(CPTI基因不含有内含子)，CPTI基因的开放阅读框编码106个氨基酸，该编码蛋白N端带有一个18个氨基酸的信号肽(SignalP：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。将该基因在大肠杆菌中表达，发现其表达量较低，表达的蛋白活性较低。

由于原核表达体系通常不具有识别真核细胞信号肽并将该蛋白成功定位的功能，而成熟有活性的蛋白总是在信号肽酶切除信号肽后才能形成，同时信号肽主要含疏水性氨基酸，在原核表达体系中大量表达时常常形成包涵体。因此，本发明的发明人在表达上述CPTI基因时去除了部分信号肽序列，同时优化了序列按照尽可能的去掉信号肽序列、又要保证不破坏蛋白的二级结构的原则，把基因前30个脱氧核糖核苷酸去除，利于在大肠杆菌中表达出该基因的重组蛋白。然后将改造优化的CPTI基因的编码序列构建到原核表达载体PGEX-6p-1中；随后将构建好的CPTI表达载体转化到表达菌株BL21(DE3)中，用诱导剂IPTG(isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)诱导融合蛋白的表达；利用融合蛋白的GST标签可以与Glutathione Sephrose 4B亲和的特性，可以纯化得到纯度达到90％以上的融合蛋白GST-CPTI。

优化后CPTI基因的序列如SEQ ID No.1所示：

cttgtagggg ttactactgc agccatggat ctgaaccacc tcggaagtaa tcatcatgat     60

gactcaagcg atgaaccttc tgagtcttca gaaccatgct gcgattcatg catctgcact    120

aaatcaatac ctcctcaatg ccattgtaca gatatcaggt tgaattcgtg tcactcggct    180

tgcaaatcct gcatgtgtac acgatcaatg ccaggcaagt gtcgttgcct tgacattgct    240

gatttctgtt acaaaccttg caagtccagg gatgaagatg atgag                    285

根据本发明的豇豆胰蛋白酶抑制剂，其由核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因编码，具体地，其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

LVGVTTAAMD LNHLGSNHHD DSSDEPSESS EPCCDSCICT KSIPPQCHCTDIRLNSCHSA      60

CKSCMCTRSM PGKCRCLDIA DFCYKPCKSR DEDDE    95

因此，根据本发明的豇豆胰蛋白酶抑制剂原核表达载体，其包括上述豇豆胰蛋白酶抑制剂CPTI基因。

根据本发明的高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法包括在原核生物中表达上述述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的步骤，优选在大肠杆菌中表达。

根据本发明的高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的基因工程菌株，其具有上述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，优选为大肠杆菌重组菌株。

虽然豇豆胰蛋白酶抑制剂在一些豆类植物中含量比较丰富，但是天然提取和纯化CPTI的工艺繁琐、产量低和成本高，不适合大规模的推广和应用，制约了CPTI蛋白的在农林领域防治鳞翅目害虫的应用。

本发明的优化CPTI基因可以在大肠杆菌中高效表达，表达量显著提高，而且表达蛋白的比活也提高，在抑制剂浓度为0.05mg/mL时，抑制活性达0.204，在抑制剂浓度为0.2mg/mL时，抑制活性达0.807。

大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系。大肠杆菌表达体系的优点是，遗传学和生理学背景清楚；容易培养，特别是高密度发酵；外源基因经常可以达到高效表达。所用的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。BL21(DE3)是一个λDE3(λDE3是λ噬菌体的突变株)的溶原菌，即在BL21的染色体上整合有λDE3的一段染色体。本发明所使用的表达载体为PGEX-6p-1(GE，Healthcare)带有Ptac可诱导的强启动子，表达出N端带有一个26kDa的GST标签的融合蛋白。GST作为一种纯化的标签，可以方便地纯化纯度非常高的目的蛋白，同时GST还具有稳定分子量较小的CPTI蛋白的作用。

附图说明

图1为豇豆CPTI基因的PCR扩增产物，M：DNA分子量标准，1：阴性对照，2：CPTI基因。

图2为PGEX-6p-1-CPTI表达载体的双酶切验证，1：重组质粒双酶切的产物，M：DNA分子量标准。

图3为融合蛋白GST-CPTI诱导表达检测，M：蛋白Marker，1：IPTG诱导的菌液，2：未添加IPTG诱导的菌液。

图4为融合蛋白GST-CPTI亲和层析纯化，M：蛋白Marker，1：纯化后的融合蛋白GST-CPTI。

图5为胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制活性。

具体实施方式

实施例1豇豆基因组DNA的提取及CPTI基因的扩增产物

豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor，CPTI)基因中不含有内含子，通过提取豇豆基因组DNA，根据已经发表出来的序列设计引物，扩增出CPTI基因。

豇豆种子(购自中国农科院)种于花盆中，大约30天后取其叶片提取基因组DNA。采用The chargeswitch gDNA plant kit(购自invitrogen公司)提取豇豆基因组DNA。以上述豇豆基因组DNA为模板，利用PCR反应扩增出CPTI基因(图1)。CPTI基因的PCR产物送往上海生工生物工程有限公司测序。测序结果表明：CPTI基因的编码序列是由321bp基组成，编码106个氨基酸，含有一个终止密码子，与已经发表序列非常高的同源性(90％以上)。

实施例2改造CPTI基因

CPTI基因的开放阅读框编码106个氨基酸，该编码蛋白N端带有一个18个氨基酸的信号肽(SignalP：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。原核表达体系通常不具有识别真核细胞信号肽并将该蛋白成功定位的功能，而成熟有活性的蛋白总是在信号肽酶切除信号肽后才能形成，同时信号肽主要含疏水性氨基酸，在原核表达体系中大量表达时常常形成包涵体。按照尽可能的去掉信号肽序列，又要保证不破坏蛋白的二级结构的原则，把基因前30个脱氧核糖核苷酸去除。本发明所表达的CPTI从第11个氨基酸到第106个氨基酸。设计上、下游引物并分别引入酶切位点BamH I和Xho I。

上游引物CPTI-BamH I-F：gaa att ggatcc ctt gta ggg gtt act act

下游引物CPTI-Xho I-R：gaa att ctc gag ctc atc atc ttc atc

PCR反应程序为：95℃热变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒；30个循环，72℃延伸10分钟。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因条带。

实施例3GST-CPTI融合蛋白表达载体的构建

BamH I和Xho I双酶切CPTI基因条带和PGEX-6p-1表达载体，在T4 ligase作用下16℃过夜连接。次日，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布含氨苄抗生素固体LB平板，37℃过夜培养。菌落PCR呈阳性的克隆，提取质粒作酶切验证(图2)。将质粒送往上海生工公司测序，结果表明表达载体的构建完全正确。

实施例4GST-CPTI融合蛋白的表达

将构建好的表达载体质粒转化表达菌株BL21(DE3)。挑取单菌落至含100μg/ml氨苄抗生素的液体LB培养基中，37℃培养，待OD600达到0.5左右时，取出500μl菌液做对照，剩余菌液加入IPTG至终浓度0.5mmol/L诱导表达，37℃继续培养3小时。取500μl菌液，12000rpm离心1分钟，收集菌体，用80μlPBS重悬菌体，加入20μl 5x SDS-PAGE loading buffer，沸水煮5分钟，取10μl进行SDS-PAGE凝胶电泳(电泳结果见图3)。

实施例5GST-CPTI融合蛋白的纯化

挑取单克隆于20ml含氨苄抗生素的液体LB培养基中，37℃过夜培养。将活化的菌种按1∶100的比例接种于1L含氨苄抗生素的新鲜LB培养基中，37℃，200rpm，培养两个小时至OD600＝0.5，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，16℃过夜诱导。次日用大容量冷冻离心机4℃，4000rpm，30分钟收集菌体。然后用30ml PBS重悬，冰浴下超声裂解。细胞裂解物用高速冷冻离心机4℃，15000rpm离心30分钟。将得到的上清以1ml/min的流速上样于用PBS平衡的Glutathione Sephrose 4B层析柱，待上样结束后，继续用20倍柱体积的PBS冲洗非特异性结合的蛋白。然后用3倍柱体积的洗脱液(10mmol/L还原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗脱目的蛋白。聚丙烯凝胶电泳检测融合蛋白的纯度(图4)将洗脱下来的目的蛋白加入10kDaMillipore浓缩离心管中，将Glutathione Sephrose 4B洗脱液换成20mmol/L Tris pH 8.0，100mmol/LNaCl，3mmol/L DTT并浓缩至1.5ml。-20℃，保存。利用分光光度计测量该蛋白的280nm吸光度值，计算出1L菌液中可以得到25mg GST-CPTI蛋白。

实施例6融合蛋白GST-CPTI对胰蛋白酶的抑制活性的测定

(1)酶活抑制活性测定原理：

胰蛋白酶可作用于人工合成底物苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPNA)，释放出黄色的对硝基苯胺，该物质在410nm下有最大吸收值。胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应，使410nm吸光度值下降，其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。用分光光度计在410nm处测定吸光度值的变化，可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。

(2)溶液的配制

称取胰蛋白酶30.0mg(Trypsin 1：250，porcine pancrease)溶于5mmol/L CaCl₂和1mmol/LHCl溶液(pH3.0)，并定容至100ml。保存于4℃冰箱中。

称取60mg的BAPNA用1ml二甲基亚砜(DMSO)溶解，然后用50mmol/LTris-HCl(pH8.1)和5mmol/L CaCl₂溶液定容至100ml。

(3)融合蛋白GST-CPTI抑制胰蛋白酶活性的测定方法：

对照组：

取200μl纯化的蛋白GST-CPTI(不同浓度)到750μl BAPNA溶液(37℃预热)中，37℃反应10分钟，立即用100μl醋酸溶液终止该反应，然后加入200μl胰蛋白酶，混合均匀。以水为空白，410nm测定吸光度值A1。

抑制组：

取200μl纯化的蛋白GST-CPTI(不同浓度)加入到750μl BAPNA溶液(37℃预热)中，然后加入200μl胰蛋白酶溶液，37℃反应10分钟，立即用100μl醋酸溶液终止该反应。以水为空白，410nm测定吸光度值A2。

无抑制组：

取200μl胰蛋白酶溶液加入到750μl BAPNA溶液(37℃预热)中，37℃反应10分钟，加入100μl醋酸溶液终止该反应，然后再加入200μl纯化的蛋白GST-CPTI(不同浓度)，混合均匀。以水为空白，410nm测定吸光度值A3。

融合蛋白GST-CPTI对胰蛋白酶活性的抑制

结果见图五。

上述实验数据结果表明随着抑制剂(GST-CPTI)浓度的升高对胰蛋白酶的抑制程度就越高。该方法制备的豇豆胰蛋白酶抑制剂(GST-CPTI)保持了与胰蛋白酶的较高的生物结合活性，这为胰蛋白酶抑制剂的开发利用和推广奠定了基础。