基于生物信息学的慢性肾脏病尿液mRNA生物标志物研究

摘要

目的： 慢性肾脏病（CKD）是全球重大公共卫生问题，目前尚缺乏早期准确的诊断方法。近年研究表明，尿液mRNA检测可能为慢性肾脏病早期无创诊断提供新颖有效的手段。然而，由于CKD发病机制及尿液细胞来源的复杂性，目前尿液mRNA的诊断准确性仍有待进一步提高。近年来，生物信息学的蓬勃发展为生物标志物研究提供了新的契机。因此，本研究目的在于：利用生物信息学，系统研究CKD转录组学特征，筛选可用于CKD早期无创诊断的新型尿液mRNA生物标志物，并开发可快速准确检测所筛选分子的TaqMan探针一步法荧光定量PCR试剂盒。 方法： 1.自gene expression omnibus数据库收集包括糖尿病肾脏病（DKD）、高血压肾病（HN）、局灶节段性肾小球硬化（FSGS）、膜性肾病（MN）及IgA肾病（IgAN）等在内的超250例基因芯片数据集（含肾小球及肾小管区域）。利用生物信息方法，寻找上述疾病的差异表达基因（DEG）集合，取交集后即得到CKD在肾小球及肾小管区域中的共差异表达基因。对共差异表达基因进行基因本体（GO）和通路富集分析，并构建CKD蛋白质-蛋白质相互作用网络（PIN），从而系统揭示CKD转录组学特征及其病理生理含义。 2.以DKD为目标疾病，提取第一部分研究中的DKD及正常肾脏组织特征转录组，并将其与尿液干扰组织细胞（正常膀胱组织、膀胱癌组织以及尿路感染炎症细胞）的转录组进行整合分析，筛选出在肾脏组织中高表达，但在其他干扰组织细胞中低表达的差异基因，并以差异表达倍数（FC）最高的基因为基础构建PCR芯片。进一步开展横断面研究评估所筛选的mRNA对糖尿病肾脏病（DKD）的早期诊断价值，纳入受试者共计82例，包括健康对照(HC)组14例，正常白蛋白尿糖尿病患者(NA)组16例，微量白蛋白尿DKD患者(MA)组11例，大量白蛋白尿DKD患者(OA)组12例，糖尿病终末期肾脏病患者(ESKD)组13例，尿路感染患者(UTI)组及膀胱癌患者(BC)组各8例。以上述PCR芯片测定所有受试者的尿液mRNA表达谱，挑选在DKD患者尿液中差异表达的基因，分析目标尿液mRNA与临床指标的相关性及对各组人群的区分效能。进一步通过生物信息学方法及荧光原位杂交（FISH）分析其在人体组织的原位表达情况，验证其组织表达特异性。 3.基于业已建立的尿液mRNA检测技术，选取61种肾脏纤维化相关基因并构建肾脏纤维化靶向PCR芯片。开展2段式横断面研究（2-stage cross-sectional study）验证相应尿液mRNA在肾脏纤维化中的诊断作用。其中一阶段研究选取在东南大学附属中大医院住院治疗的62例经肾脏活检证实的CKD患者和14例HC，是为筛查组；二阶段研究则另外选取41例经肾脏活检证实的CKD患者和9例HC，是为验证组。使用所构建的肾脏纤维化靶向荧光定量PCR芯片检测尿沉渣细胞mRNA表达水平。在筛查组和验证组中应用平衡迭代随机森林算法选择能够反映有无小管间质纤维化(TIF)及肾小球硬化(GS)的重要尿液mRNA；分析目标尿液mRNA与TIF、GS评分间的相关性；评估单个尿液mRNA、肾功能指标及基于随机森林分类算法的联合生物标志物对肾脏纤维化的诊断能力，并比较之。 4.以第二、三部分筛选得到的候选分子为基础，从NCBI上下载相应基因及内参基因的基因全序列，并据此设计特异性引物和TaqMan探针。按适宜浓度配制引物探针混合液、PCR酶混合液和MasterMix，不断优化PCR反应条件，从而建立可快速检测上述基因的TaqMan探针荧光定量PCR一步法试剂盒。最后设立浓度梯度对试剂盒进行重复性、敏感性验证。 结果： 1.基于大数据分析，我们系统构建了常见CKD（DKD、HN、FSGS、MN及IgAN）的特征转录组学表达谱。此外，我们在肾小球和肾小管区域分别找出了176个和50个CKD共差异表达基因，许多基因参与CKD发生发展的机制尚未见报道。富集分析表明，众多不同的分子通路参与肾小球和肾小管间质慢性损伤，并且DEG显著富集于外泌体。通过构建PIN，我们进一步找出了若干个核心基因（如OAS1、JUN和FOS）和分子聚类，它们可能在CKD的发展中起着重要的作用。 2.通过分析比对DKD肾脏组织及其它组织的特征基因表达谱，我们筛选出16个FC最高的候选mRNA构建靶向PCR芯片。以该芯片检测受试者尿液mRNA表达水平，结果显示基因扩增曲线图谱呈S型，熔解曲线分析呈单峰，可实现特异性测定。经分析，四种mRNA(BBOX1,CCL18,NPHS2以及SLC3A1)在DKD患者尿液中较HC组表达水平上调。在使用Benjamini-Hochberg法进行多重校正后，尿液BBOX1mRNA仍呈显著差异表达。进一步分析表明，NA组及DKD组受试者尿液BBOX1mRNA表达水平则分别升高了3倍及3.1倍，而其在ESKD、UTI及BC组患者中则无明显升高。此外，尿液BBOX1mRNA与尿白蛋白水平、血糖控制水平及尿NAG水平相关（Spearman’s r:0.292~0.407），但与肾功能水平无明显相关。受试者工作曲线（ROC）分析进一步提示尿液BBOX1mRNA对于糖尿病及非糖尿病受试者具有较好的区分度（AUC：0.762~0.805）。生物信息学分析提示在BBOX1表达水平在DKD肾脏病理组织及正常肾脏组织中表达并无显著差异，FISH结果则进一步表明BBOX1在TEC中显著表达，在肾小球区域及膀胱上皮组织中表达甚微，进一步提示尿液中升高的BBOX1mRNA主要来源于TEC。 3.经平衡迭代随机森林算法分析，我们从尿液肾脏纤维化靶向PCR芯片检测结果中筛选出了4个TIF相关重要分子，即VIM，TGFβ1,MMP9及TIMP2。单指标方面，筛选所得的4个mRNA与TIF评分显著相关（Spearman’s r:0.281~0.397）。ROC分析表明，它们对有无TIF有较好的鉴别诊断能力(AUC：0.727~0.757)。特别的，在选取最佳截断值时，上述指标都拥有良好的敏感性（76.2%~97.6%）。联合指标方面，我们同时构建了包含上述4个mRNA的随机森林分类器，并在二阶段研究中进行验证，结果表明，其准确度为0.796（敏感性为0.929，特异性为0.619）。联合eGFR后，分类的准确性提高到0.877（敏感性为0.964，特异性为0.762）。而血清肌酐和eGFR的预测准确率仅为0.673及0.714。在肾小球硬化（GS）方面，我们同样利用上述算法筛选出了4个相关重要基因，分别是VIM，TGFβ1，RANTES及PODXL。它们与GS评分显著相关（Spearman’s r:0.263~0.406）。 4.通过优化PCR各体系组分及反应条件，我们开发的TaqMan探针一步法荧光定量PCR试剂盒可实现尿液中BBOX1、VIM、TGFβ1、MMP9、TIMP2以及B2M（内参基因）等六种mRNA有效扩增及定量检测。重复性及敏感性验证表明，本试剂盒的变异系数＜0.5%，具有良好的检测稳定性，可从低至0.5ng/10ul体系的尿沉渣mRNA中检测相应mRNA表达水平，具有良好的灵敏度。整个扩增定量过程可在1h内完成，较传统PCR方法大大减少了检测时间。 结论： 1.本研究开展了目前为止包含最大样本量的CKD生物信息学分析，我们系统构建了CKD肾脏组织的转录组学特征，相关DEG及分子模式为进一步挖掘CKD生物标志物及机制探讨提供了重要参考。 2.本研究首次建立了一种基于生物信息学的尿液肾脏固有细胞特异性mRNA筛选方法，并发现uBBOX1可能成为DKD患者早期无创诊断的新型生物标志物。 3.本研究首次利用随机森林算法实现了反映肾脏纤维化的特征性尿液RNA筛选，并构建了基于上述算法的多指标分类器，可较单指标尿液mRNA或肾功能指标更好的诊断肾脏纤维化。 4.本研究建立了检测上述尿液mRNA的TaqMan探针一步法荧光定量PCR试剂盒，具有特异性好、灵敏度高、快速简便等优点，为日后大规模临床验证及转化提供了便利有效的检测手段。

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