牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因的克隆及PCR诊断方法的建立

摘要

牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫（Theileria sergenti）寄生于牛红细胞和淋巴细胞而引起的一种血液原虫病。近些年，瑟氏泰勒虫病的发生呈上升趋势，给相关国家的畜牧业带来了较大的经济损失，引起了国内外兽医界的广泛关注。因此有必要建立一种快速、敏感、特异诊断方法，以便进行牛瑟氏泰勒虫病的早期诊断和预防。
　　本试验根据GenBank中报道的牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因序列，设计了两对特异性引物，扩增两条特异性基因片断，再去除重复区，经过拼接得到牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因全序列，进行核苷酸序列分析及同源性比较。再以牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因为靶基因，设计特异性引物建立PCR诊断方法，并进行应用试验。
　　结果表明，PCR扩增出长为1173 bp和1440 bp两条特异性基因片断，去除重复区拼接得到全长为1744 bp的牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因序列。同源性比较结果表明，牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)与水牛泰勒虫(Theileria buffeli)同源性最高，为99％，与突变泰勒虫同源性最低，为95%。建立的PCR诊断方法不与新孢子虫、弓形虫、羊泰勒虫发生交叉反应，最高敏感度DNA为5.3 fg/μL。对50份样本DNA进行检测，本方法阳性检出率(64.0%)高于金春梅方法阳性检出率(58%)。
　　本研究为我国瑟氏泰勒虫分子分类学、遗传学以及诊断工作奠定理论基础，为牛瑟氏泰勒虫病的诊断、流行病学调查提供特异、快速、灵敏、简便、高效的诊断方法，以便有效地控制该病的发生与流行。

目录

声明

前言

1 牛瑟氏泰勒虫病概况

2 牛瑟氏泰勒虫病诊断技术研究进展

3 18S rRNA基因的研究进展

4 本研究的目的和意义

材料与方法

1 材料

2 方 法

结果

1 不同血液抗凝剂抗凝效果的比较

2 提取的DNA样品质量的比较结果

3 PCR扩增结果

4 重组质粒的鉴定结果

5 核苷酸序列的测定及分析

6 PCR诊断方法的建立

7 应用试验

讨论

1 不同抗凝剂对虫体基因组DNA提取质量的影响

2 牛瑟氏泰勒虫延边株18S rRNA基因序列分析

3 牛瑟氏泰勒虫PCR方法的建立

4 应用试验

结论

参考文献

致谢

作者简介