发酵轮叶党参提取物诱导HepG-2细胞凋亡作用研究

摘要

目的:
　　肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，发展迅速。由于我国人民油腻饮食和乙肝患者的增多，肝癌的患病率和病死率在逐年升高，因此肝癌作为人类因癌症死亡的主要杀手已经引起人们的高度重视。轮叶党参属于多年生漫生草本，多以其根入药，也是民间喜食的山野菜之一，属于药食兼用型植物。它含有多种营养素及皂苷类、黄酮类等植物化学成分。本实验通过体外培养人肝癌HepG-2细胞，探讨发酵轮叶党参正丁醇萃取物诱导HepG-2细胞凋亡作用及其作用机理，为开发新型的肝癌化学预防剂提供理论基础。
　　方法:
　　①用活性酵母发酵轮叶党参，经乙醇提取、正丁醇萃取而获得发酵轮叶党参提取物(FCLE)；②体外培养HepG-2细胞，取1×104个的细胞，药物组分为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL，采用MTT法检测其对细胞增殖的抑制作用，并用SPSS17.0统计软件计算出药物的半数抑制浓度(IC50)；③体外培养HepG-2细胞，取1×104个的细胞，利用FCLE不同药物浓度，采用吖啶橙(AO)染色法，荧光显微镜下观察HepG-2细胞凋亡的形态学特征；④体外培养HepG-2细胞，取1×104个的细胞，利用FCLE不同药物浓度，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率；⑤体外培养HepG-2细胞，取1×104个细胞，根据FCLE不同药物浓度，利用Caspase活性检测试剂盒，分别检测Caspase-3、8、9的活性；⑥体外培养HepG-2细胞，取1×104个的细胞，根据FCLE不同药物浓度，利用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒，进行细胞周期与细胞凋亡的相关分析。
　　结果:
　　①MTT实验结果显示，FCLE药物浓度越高，其对HepG-2细胞增殖的抑制作用越强，呈浓度依赖性，其IC50为239.623μg/mL；
　　②AO染色法荧光显微镜下可见，正常细胞核染色质结构正常，胞膜完整，胞质呈红色荧光；凋亡细胞，核染黄绿色荧光，呈致密斑块或碎片状，可见包膜泡状膨突和凋亡小体；
　　③流式细胞仪检测结果表明，随着药物浓度的升高，其凋亡率随之升高，并且100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组的凋亡率均显著高于空白对照组的凋亡率，(P<0.01)，不同药物浓度组间凋亡率比较，200μg/mL药物组的凋亡率均显著高于100μg/mL和150μg/mL药物组的凋亡率，150μg/mL药物组的凋亡率亦显著高于100μg/mL药物组的凋亡率(P<0.01)；
　　④Caspase-3、8、9活性检测结果表明，100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组的Caspase-3的活性均显著高于空白对照组的Caspase-3活性(P<0.01)，各药物浓度组间比较没有差异(P>0.05)；100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组的Caspase-8的活性均显著高于空白对照组的Caspase-8活性(P<0.01)，200μg/mL药物组的Caspase-8活性高于100μg/mL药物组的Caspase-8活性(P<0.05)，其他药物浓度组间比较没有差异(P>0.05)；100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组Caspase-9的活性均显著高于空白对照组的Caspase-9活性(P<0.01)，150μg/mL、200μg/mL药物组的Caspase-9活性亦显著高于100μg/mL药物组的Caspase-9活性(P<0.01)，150μg/mL、200μg/mL之间比较没有差异性(P>0.05)。
　　⑤细胞周期检测结果表明，100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组三种浓度均可将人肝癌细胞HepG-2周期阻滞在G0/G1期，G0/G1期细胞数的比例明显增多，而S期和G2/M期细胞比例明显减少，与空白对照组比较，100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组G0/G1期细胞所占比例明显高于空白对照组，而S期的细胞所占比例明显低于空白对照组(P<0.01)。
　　结论:
　　1. FCLE可抑制HepG-2细胞的增殖，并且随着药物浓度的升高，抑制作用增强；
　　2. FCLE可促进HepG-2细胞凋亡，在本实验剂量范围内，药物浓度越高，其促凋亡作用越明显；
　　3. FCLE可通过激活Caspase-8，再向下激活Caspase-9，进而激活下游的Caspase-3，最终诱导HepG-2细胞发生凋亡；
　　4. FCLE可将HepG-2细胞阻滞在G0/G1期，并呈浓度依赖性。

目录

声明

第一章 前 言

第二章 材料与方法

2.1发酵轮叶党参正丁醇提取物的制备

2.1.1材料

2.1.2样品的制备

2.2仪器与试剂

2.2.1仪器

2.2.2试剂和细胞株

2.2.3相关溶液的配制

2.2.4实验用药物浓度配制

2.2.5 HepG-2细胞培养

2.3实验方法

2.3.1发酵轮叶党参正丁醇提取物最佳溶剂筛选实验

2.3.2测定发酵轮叶党参正丁醇提取物对HepG-2细胞的抑制作用

2.3.3 AO染色法荧光显微镜下观察

2.3.4流式细胞仪检测细胞凋亡

2.3.5 Caspase-3活性检测

2.3.6 Caspase-8活性检测

2.3.7 Caspase-9活性检测

2.3.8 细胞周期的检测

2.4 统计学处理

第三章实验结果

3.1 FCLE不同溶剂对MTT试验结果的影响

3.2 FCLE对HepG-2细胞增殖的抑制作用

3.3 FCLE诱导HepG-2凋亡的作用

3.3.1 AO染色法荧光显微镜下观察

3.3.2流式细胞仪测定细胞凋亡率的结果

3.4 Caspase-3，8，9活性检测结果

3.4.1 Caspase-3，8，9的标准曲线

3.4.2 Caspase活性检测结果

3.5 FCLE对HepG-2细胞周期的影响

第四章 讨 论

参考文献

第五章 结 论

致谢

综述:肿瘤细胞凋亡机制的研究进展