蝙蝠葛活性成分抗胃癌细胞作用和机制的研究

摘要

研究背景与目的：胃癌在我国的发病率和死亡率都非常之高，是消化道恶性肿瘤之首。早期胃癌的手术，治愈率还是很高的，但是胃癌本身缺乏特异性临床表现，近80％的患者就诊时就已经属于中晚期，失去了手术机会。此外胃癌患者在手术后很容易复发，尤其是有淋巴结转移者。对这些失去手术机会以及术后复发的患者，化疗是最主要的治疗手段之一。目前新辅助化疗，靶向药物治疗等取得了非常大地进步，但是胃癌的5年生存率还是没有得到明显地改善。因此，需要寻找一种新的更有效的抗肿瘤药物，增强胃癌的治疗疗效，改善患者的生活质量，延长患者的生存时间。
　　当前，对抗肿瘤药物的研究已经逐渐地转向了天然药物，故我国传统的中药越来越受到科学家们的关注，成为了肿瘤治疗的一大特色。大量的临床实践表明单独使用中药或者中西医结合治疗肿瘤，其疗效确切，并能减轻放疗、化疗的毒副作用。不仅如此，中草药可以相对减轻患者的经济负担，这也是中草药的独到之处。故对中草药治疗肿瘤的机制研究也越来越多，其中蝙蝠葛具有多种生物学活性，其根、茎叶、果实均有良好的药理效应，具有较好的应用前景和开发前景。现代研究认为蝙蝠葛活性成分除了具有抗菌、抗病毒和杀虫作用外，还具有较好的体内外抗肿瘤作用，而该作用也得到医学界越来越多的关注。蝙蝠葛活性成分对胃癌作用的报道比较少见，我们在多种细胞系中选择了胃癌SGC-7901细胞株，进一步探讨了其抗肿瘤作用及抑制转移侵袭作用。本实验所用的药物蝙蝠葛活性成分由延边大学天然药物研究所提供，由我们实验室用MTT等检测方法一步一步地筛选其有效成分，现已经接近于单体。其具体化学方程式正在进一步检验中。
　　本研究采用MTT法检测了蝙蝠葛活性成分体外对多种肿瘤细胞株的抗增殖作用，包括了人肺癌A-549细胞株，人肝癌HepG2细胞株，人肝癌Hep3B细胞株，人宫颈癌Hela细胞株，人乳腺癌MCF-7细胞株，人白血病K-562细胞株，人胃癌MGC-803细胞株，人胃癌SGC-7901细胞株和小鼠黑色素瘤B-16细胞株；研究了蝙蝠葛活性成分对人肺癌A-549细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用；利用免疫细胞化学染色方法观察了蝙蝠葛活性成分对人胃癌SGC-7901细胞中Ki-67基因蛋白的表达变化；特殊染色后应用倒置显微镜、荧光显微镜、透射电镜观察了蝙蝠葛活性成分引起人胃癌SGC-7901细胞形态学方面的变化；应用了TUNEL检测法、DNA ladder电泳法、Annexin-PI双染流式细胞仪检测法观察了蝙蝠葛活性成分诱导人胃癌SGC-7901细胞的凋亡作用；利用PI染色、流式细胞仪观察了对照组细胞和实验组细胞的细胞周期分布的变化；应用western blotting方法和流式细胞仪观察了细胞周期相关蛋白和凋亡通路相关蛋白表达的变化；通过划痕实验，transwell实验观察了蝙蝠葛活性成分对人胃癌SGC-7901细胞的运动能力，迁移能力以及侵袭能力的影响；用western blotting实验方法观察了蝙蝠葛活性成分降低人胃癌SGC-7901细胞转移侵袭作用的具体机制。通过这一系列的实验，较为深入地研究蝙蝠葛活性成分的抗肿瘤作用及其机制，有望能为将来采用蝙蝠葛活性成分进行抗癌治疗提供理论依据和实验基础。
　　本研究的主要方法和结果：
　　1、MTT比色法检测细胞活力。MTT结果显示蝙蝠葛活性成分对人肺癌A-549细胞株，人肝癌HepG2细胞株，人肝癌Hep3B细胞株，人宫颈癌Hela细胞株，人乳腺癌MCF-7细胞株，人白血病K-562细胞株，人胃癌MGC-803细胞株，人胃癌SGC-7901细胞株和小鼠黑色素瘤B-16细胞株均有明显抑制增殖作用，IC50值分别为4.58μg/ml，5.14μg/ml，6.21μg/ml，4.34μg/ml，3.00μg/ml，2.93μg/ml，3.92μg/ml，3.77μg/ml，6.22μg/ml。我们可以认为蝙蝠葛活性成分具有广谱的体外抗肿瘤作用，其中对人白血病K-562细胞作用最强。此外，对人胃癌SGC-7901细胞株也表现出较好的抗增殖作用。
　　2、蝙蝠葛活性成分对人肺癌A-549细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用将裸鼠随机分为4个组进行观察。阳性药MMC组的T/C值为6.0%，对裸小鼠移植瘤的生长具有显著的抑制作用。蝙蝠葛活性成分低剂量组T/C值为68.4%，对裸小鼠移植瘤的生长无明显的抑制作用。高剂量组的T/C值为58.8%，并P<0.05,故可以认为对裸小鼠移植瘤的生长具有抑制作用。各实验组裸鼠生长情况良好，整个实验过程均无死亡。阳性对照组，MMC组体重相对较轻，蝙蝠葛活性成分组体重均有增加，与阴性对照组相比无明显差异。
　　3、免疫细胞化学染色检测Ki-67蛋白的表达。本实验利用免疫细胞化学检测方法观察了蝙蝠葛活性成分对人胃癌SGC-7901细胞中的细胞增殖核抗原Ki-67表达的影响，发现它的表达水平发生了明显的改变。对照组细胞Ki-67主要表达在细胞核，为深棕色，并且细胞生长旺盛；实验组细胞变小变圆、成固缩状，几乎看不到棕色颗粒，细胞数目少。Ki-67蛋白阳性表达率，对照组为89.3%，实验组为10.1%，其差异具有统计学意义。蝙蝠葛活性成分明显地降低了人胃癌SGC-7901细胞中Ki-67蛋白的表达，抑制了胃癌细胞的增殖能力。
　　4、形态学观察。应用倒置显微镜观察到了对照组细胞原本贴壁生长良好，经蝙蝠葛活性成分作用之后细胞变圆，贴壁不牢固，细胞生长明显受到抑制。HE染色、应用光学显微镜我们观察到了与倒置显微镜相同的改变，并可见染色质边集，细胞固缩，凋亡小体等典型的凋亡形态学改变。Hoechst33258染色发现蝙蝠葛活性成分作用之后的实验组细胞出现了染色质固缩，细胞核呈致密浓染和碎块状，颜色有些发白等典型的凋亡形态学改变。AO/EB荧光染色法是一种鉴别细胞坏死与凋亡的简便方法，实验结果发现蝙蝠葛活性成分引起了胃癌细胞的凋亡，很少看见坏死肿胀的细胞。透射电镜结果在微观水平上进一步证实了这一观点。上述实验运用多种特殊染色，通过多种显微镜均观察到了典型的凋亡形态学改变，从而能得出蝙蝠葛活性成分在体外引起了胃癌细胞凋亡的结论，可以看出它具有进一步研究的价值。
　　5、TUNEL检测法。通过TUNEL检测法发现对照组细胞在光学显微镜下，细胞生长旺盛，铺满整个盖玻片，但是在荧光显微镜下仅能见到少数的细胞；而实验组细胞在光学显微镜下观察到细胞数明显变少，但是在荧光显微镜下可以观察到更多的发出绿色荧光的细胞。可以看出蝙蝠葛活性成分作用之后人胃癌SGC-7901细胞发生了的凋亡的改变。
　　6、Annexin-PI双染法。Annexin V-Alexa Fluor和PI双染后利用流式细胞仪观察到对照组中正常细胞占大多数，平均凋亡率仅为5.12±0.87%；而实验组中正常细胞变少，凋亡细胞数变多，平均凋亡率为37.84±2.01%，并且其差异具有统计学意义。
　　7、DNA ladder电泳检测。电泳结果发现对照组细胞DNA在胶顶部，呈现出一个高分子量条带；实验组细胞形成明显的DNA梯度，呈阶梯状排列。说明蝙蝠葛活性成分诱导了人胃癌SGC-7901细胞的凋亡，引起了DNA降解。
　　8、细胞周期分布的影响。用PI染色、酒精处理之后利用流式细胞仪观察到蝙蝠葛活性成分显著改变了人胃癌SGC-7901细胞的细胞周期分布。对照组G0/G1期细胞占55.17%，G2/M期细胞占13.07%，S期细胞占31.76%；而实验组G0/G1期细胞明显增多，为74.26%，G2/M期和S期细胞百分比均比对照组减少，分别为8.61%和17.13%。可以看出蝙蝠葛活性成分明显改变了胃癌细胞周期的分布，使G1期细胞的百分比明显增高，S和G2期细胞明显降低，使细胞阻滞在G1期，干预了细胞增殖。
　　9、细胞周期相关蛋白CyclinD1和p16。通过western blotting方法检测了CyclinD1和p16蛋白的表达变化。发现了蝙蝠葛活性成分明显下调了CyclinD1的表达水平，并上调了抑制因子p16基因蛋白表达水平，可以认为蝙蝠葛活性成分是通过调节上述基因蛋白的表达，启动了G1/S期监测点，干预了细胞周期的进行。
　　10、流式细胞仪检测线粒体膜电位的改变。用JC-1荧光染色细胞后利用流式细胞仪检测了线粒体膜电位的改变，发现蝙蝠葛活性成分作用之后线粒体膜电位下降，并且与对照组相比其差异具有统计学意义。线粒体跨膜电位的下降发生在细胞凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，它被认为是细胞凋亡级联反应过程中发生的最早事件。一旦线粒体膜电位崩溃，细胞凋亡就会不可逆转。
　　11、检测线粒体通路相关蛋白Bax和Bcl-2。用western blotting方法来检测胃癌SGC-7901细胞中的Bax和Bcl-2基因蛋白，发现蝙蝠葛活性成分能够上调Bax基因蛋白的含量，下调了Bcl-2基因蛋白的含量，Bcl-2/Bax比例明显减小，并且与对照组相比其差异均有统计学意义。这两种基因是线粒体通路中的关键蛋白酶，Bcl-2（抗凋亡因子）和Bax（促凋亡因子）与线粒体相互作用，改变跨膜电位，改变线粒体的通透性。
　　12、Caspase-3活性检测。在很多凋亡，不管是哪种因素，哪种途径，最终都要通过Caspase介导的信号途径导致细胞的凋亡，利用Caspase-3活性检测试剂盒，观察到蝙蝠葛活性成分明显提高了 Caspase-3的活性，当终浓度分别为2.5、5、10μg/ml的蝙蝠葛活性成分作用之后 Caspase-3的活性比对照组分别增高了1.37倍、2.5倍、2.7倍，并且与对照组相比具有统计学意义。还观察到了Caspase-3的活性与细胞存活率成负相关，可以认为Caspase-3的活性增高使胃癌SGC-7901细胞的死亡增加，而Caspase-3是诱导凋亡的关键执行分子，Caspase-3的表达上调可以认为是细胞凋亡的特异性标志。
　　13、细胞划痕实验。细胞划痕实验，实验成本低，是一种简单易行地检测细胞运动能力的方法。本实验发现与对照组相比较，蝙蝠葛活性成分处理之后，细胞修复该划痕的能力减低。结果表明蝙蝠葛活性成分抑制了胃癌SGC-7901细胞的运动能力。
　　14、Transwell迁移实验。蝙蝠葛活性成分作用之后使人胃癌SGC-7901细胞对聚碳酸酯膜的迁移运动能力下降，其差异具有统计学意义，并且浓度越高其抑制作用就越强。
　　15、Transwell侵袭实验。Transwell侵袭实验方法与transwell迁移实验方法相似，不同的是transwell侵袭实验中在聚碳酸酯膜上涂抹matrigel胶，肿瘤细胞必须降解此成分才能穿过去，本实验发现蝙蝠葛活性成分不仅使迁移能力降低，还可使人胃癌SGC-7901细胞的侵袭能力下降，其差异具有统计学意义，并且浓度越高其抑制作用就越强。
　　16、检测侵袭转移相关蛋白MMP-2和Nm23。通过western blotting方法检测了侵袭转移相关蛋白MMP-2和Nm23的表达变化。发现了蝙蝠葛活性成分明显下调了MMP-2的表达水平，并上调了抑制因子Nm23的蛋白表达水平，可以认为蝙蝠葛活性成分通过调节上述基因蛋白的表达，来达到抑制胃癌SGC-7901细胞株转移侵袭作用的。
　　研究结论：
　　1.蝙蝠葛活性成分在体内和体外均表现出了较好的抗肿瘤作用。
　　2.蝙蝠葛活性成分通过线粒体途径启动和完成人胃癌SGC-7901细胞凋亡。
　　3.蝙蝠葛活性成分诱导凋亡作用可能与细胞周期发生G1期阻滞有关。
　　4.蝙蝠葛活性成分能使胃癌细胞的迁移运动能力，侵袭能力下降。这可能与下调MMP-2，上调Nm23蛋白表达有关。
　　5.蝙蝠葛活性成分有望开发成一种新的抗肿瘤药物。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

本实验研究技术路线图

第一章 绪 论

第二章 蝙蝠葛活性成分体内外抗肿瘤作用

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学处理

2.4 结果与分析

2.5 讨论

2.6 本章小结

第三章 蝙蝠葛活性成分对胃癌细胞的抗增殖及诱导凋亡作用

3.1实验材料

3.2 实验方法

3.3 统计学处理

3.4 结果与分析

3.5 讨论

3.6 本章小结

第四章 蝙蝠葛活性成分抑制胃癌SGC-7901细胞侵袭转移的作用

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 统计学分析

4.4 结果与分析

4.5 讨论

4.6 本章小结

第五章 结 论

致谢

参考文献

【综述】:蝙蝠葛药理作用的研究进展

附录1攻读博士学位期间发表的学术论文情况