蝙蝠葛活性成分抗肿瘤作用及机制的研究

摘要

目的：研究蝙蝠葛活性成分体外对人白血病K562细胞株的抑制增殖和诱导凋亡作用，并探讨其作用机制，以及蝙蝠葛活性成分体内对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用，为新药开发提供实验和理论依据。
　　方法：应用MTT法检测蝙蝠葛活性成分对体外培养的人白血病K562细胞株的抑制增殖作用的影响及细胞毒活性；通过倒置显微镜、HE染色及透射电镜对K562细胞进行形态学观察；采用流式细胞仪检测K562细胞的周期分布相和细胞凋亡率；通过免疫细胞化学S-P法测定凋亡关键效应酶Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的表达情况，深入探讨蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株诱导凋亡的机制；采用寇氏（Korbor）法计算小鼠急性经口LD50及其95％可信限；用蝙蝠葛活性成分灌胃观察其对S180荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用；采用血清药理学实验方法，观察含药血清体外对人肺癌A549细胞株抗增殖作用；采用生命延长率实验方法，用蝙蝠葛活性成分灌胃观察其对S180肉瘤小鼠的生命延长作用。
　　结果：
　　（1）MTT比色法结果表明，蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株的增殖抑制作用呈剂量依赖性；
　　（2）倒置显微镜观察：蝙蝠葛活性成分20μg/ml作用后早期细胞出现凋亡形态学变化：细胞膜鼓泡、凋亡小体形成等；作用晚期细胞发生膜破裂坏死；
　　（3）HE染色：蝙蝠葛活性成分20μg/ml作用细胞后出现典型凋亡形态变化凋亡小体形成、细胞核浓缩呈蓝黑色、胞浆呈淡红色等，核染色质浓缩、呈碎块状；
　　（4）透射电镜观察结果：蝙蝠葛活性成分20μg/ml作用细胞后出现核染色质致密浓缩或断裂，形成大小不等的凋亡小体；
　　（5）流式细胞仪检测结果显示：蝙蝠葛活性成分可以诱导K562细胞发生凋亡，加药组出现亚二倍体峰，并且 GO/G1期细胞比例显著增加，而S期和 G2/M期细胞比例则明显下降,将细胞阻滞在 GO/G1期；
　　（6）免疫细胞化学结果表明：蝙蝠葛活性成分作用后加药组Caspase—9、Caspase-8和Caspase-3表达增加，与对照组相比较均有显著差异；
　　（7）急性毒性实验结果，蝙蝠葛活性成分的小鼠急性经口LD50及其95%可信限为52.72g/kg和38.12—63.87 g/kg；
　　（8）蝙蝠葛活性成分小、中、大剂量组对小鼠移植性肉瘤S180实体瘤的抑瘤率分别为17.19%、33.43%、42.29%，有显著的抑制作用；
　　（9）血清药理学实验结果，终浓度分别为10%、20%、25%的灭活的含药（蝙蝠葛活性成分）大白鼠血清对 A549细胞株的增殖抑制率分别为29.03%、30.55%、41.67%，对照组相比P＜0.05；
　　（10）生命延长率实验结果小剂量及中剂量组延长率为41.66%与33.33%，与对照组相比P＜0.05。
　　结论：
　　1、蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株具有抑制增殖和诱导凋亡作用。
　　2﹑蝙蝠葛活性成分对K562细胞抑制增殖作用在20μg/ml作用24h之前主要以诱导凋亡为主。
　　3、蝙蝠葛活性成分诱导凋亡作用机制可能与细胞周期发生 G0/G1期阻滞有关；并且通过上调Caspase-9、spase-8和Caspase-3蛋白表达，经由细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路完成凋亡的启动和执行。
　　4、蝙蝠葛活性成分对S180荷瘤小鼠具有延长生命的作用，同时对小鼠移植性S180肉瘤具有抑制作用。
　　5、蝙蝠葛活性成分含药血清在体外对人肺癌A549细胞株增殖有抑制作用。
　　6、急性毒性实验结果，蝙蝠葛活性成分属低毒中药，具有显著的抑肿瘤作用，有望开发成一种新的抗肿瘤药物。

目录

声明

前言

第一章 材料与方法

1.1材料

1.２方法

1.3统计学处理

第二章 结果

2.1 MTT法检测蝙蝠葛活性成分对K562细胞株的抗增殖作用

2.2 K562人白血病细胞的形态学改变

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期改变

2.4凋亡关键效应酶与凋亡相关基因蛋白表达水平的检测

2.5急性毒性实验结果

2.6蝙蝠葛活性成分对小鼠S180实体瘤的抑瘤作用

2.7蝙蝠葛活性成分含药血清对肺癌A549细胞株的增殖抑制作用

2.8蝙蝠葛活性成分对S180肉瘤荷瘤小鼠生命延长率的影响

附图

第三章 讨论

3.1 蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株的增殖抑制作用

3.2 蝙蝠葛活性成分对人白血病K562细胞株的诱导凋亡作用

3.3 蝙蝠葛活性成分对人白血病 K562 细胞株细胞凋亡通路的调控作用

3.4蝙蝠葛活性成分体内抑瘤作用

3.5蝙蝠葛活性成分含药血清体外对肺癌A549细胞的影响

第四章 结 论

致谢

参考文献

综述:蝙蝠葛的研究进展