垂盆草介导Sirt1-AMPK-LXR信号通路改善二甲基亚硝胺所致肝纤维化作用机制的研究

摘要

目的:
　　肝纤维化是由多种致病因素引起的肝内结缔组织发育不良的病理过程，肝纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化。在肝纤维化过程中，其特征是肝星状细胞和其他细胞外基质细胞的激活。本实验采用二甲基亚硝胺建立慢性肝纤维化体内模型和活化肝星状细胞体外实验，探究垂盆草（Sedum sarmentosum Bunge，SS）改善肝纤维化进程、脂质沉积、细胞凋亡以及炎症因子的作用，并分析其围绕Sirt1-AMPK-LXR信号通路的调控机制。
　　方法:
　　体内实验中，取Wistar雄性大鼠随机分为五组，每组六只，即为正常组、DMN组、垂盆草提取物低剂量组(100mg/kg)、垂盆草提取物高剂量组(300mg/kg)和扶正化瘀阳性对照组(2g/kg)。DMN组与各药物治疗组每周连续三次腹腔注射1％ DMN(2ml/kg)诱导肝纤维化;造模的同时各治疗组分别灌胃给予垂盆草提取物（100或300mg/kg）或扶正化瘀(2g/kg)，每天一次，连续5周。在末次给药6h后，将动物安乐死，收集血液和肝组织。利用试剂盒检测血清中丙氨酸氨基转氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基转氨酶(AST)的水平。利用H&E，Masson染色和免疫组化染色方法观察垂盆草对大鼠肝组织形态学的影响;通过蛋白印迹方法和PCR法检测肝脏中α-SMA，CollagenⅠ，TIMP-1，SREBP-1，FASN, ACCa, Caspase3, Caspase9, FLIP, Bax, Bcl-2, Bid, Caspase1,TNF-α，Sirt1，AMPKα，p-AMPKα，LXRα，LXRβ蛋白或mRNA的表达。
　　体外实验中，将HSC-T6和LX-2细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)，100mg/ml青霉素和100mg/ml链霉素的培养基(DMEM)中，在37℃，5％CO2饱和湿度环境的二氧化碳培养箱中培养。将细胞以5×105/孔的密度接种在6孔板中，用TGF-β(10ng/ml)刺激HSC-T6和LX-2细胞2小时后，分别给予垂盆草提取物（6.25、12.5、25或50μg/ml）孵育24小时。收集细胞提取总蛋白和核蛋白，分别进行蛋白印迹、PCR和细胞免疫荧光分析，检测了α-SMA，CollagenⅠ，Sirt1，AMPK，p-AMPK，LXRα和LXRβ蛋白表达情况。此外，TGF-β(10ng/ml)刺激HSC-T6和LX-2细胞2小时后，再分别给予垂盆草提取物（25或50μg/ml），AICAR（AMPK激动剂）和GW3965（LXR激动剂）处理HSC-T6和LX2细胞6小时后，收集细胞提取总蛋白和核蛋白进行检测。利用蛋白印迹实验和细胞免疫荧光技术检测垂盆草对肝星状细胞中Sirt1，AMPKα， p-AMPKα，LXRα和LXRβ蛋白的表达的影响。
　　结果:
　　体内实验结果显示垂盆草提取物显著抑制二甲基亚硝胺诱导的肝损伤大鼠血清中ALT，AST活力的升高。H&E染色和Masson染色结果显示，垂盆草提取物可以显著改善二甲基亚硝胺诱导的肝组织病变，且存在剂量依赖性。同时也能够抑制肝组织中α-SMA，CollagenⅠ，TIMP-1蛋白和mRNA表达的升高，与α-SMA免疫组化结果具有一致性。RT-PCR结果显示，垂盆草提取物显著降低了SREBP1，ACCa，FASN mRNA表达。垂盆草提取物能够抑制肝脏中Caspase1，TNFα的表达;并且通过减少FLIPL表达，抑制了Bid，导致cleaved-Bid表达的升高，Bax的表达受到抑制，从而提高Bcl-2的水平。垂盆草给药组显著增加Sirt1，p-AMPKα，LXRα，LXRβ的表达水平。
　　体外实验结果显示，垂盆草提取物可以显著降低HSC和LX2细胞中α-SMA，CollagenⅠ两种纤维形成标记物的表达来抑制肝星状细胞的活化，并且免疫荧光结果较为明显看出，垂盆草明显抑制了α-SMA蛋白的表达。此外，垂盆草具有显著促进活化的肝星状细胞中Sirt1，LXRα，LXRβ和AMPK磷酸化表达的作用，具有剂量依赖性。
　　结论:
　　垂盆草通过抑制纤维化指标，减轻脂肪堆积，抑制炎症和凋亡起到肝保护作用，同时垂盆草激活Sirt1-AMPK-LXR信号通路显著抑制二甲基亚硝胺诱导肝纤维化和活化的肝星状细胞。