基于TAK1-MAPK及NF-κB信号通路粉防己碱干预肝纤维化及隐丹参酮改善暴发性肝衰竭作用机制研究

摘要

本研究采用大鼠肝星状细胞T‐HSC/Cl‐6和D‐氨基半乳糖/内毒素联合诱导的小鼠暴发性肝衰竭动物模型，分别探讨粉防己碱抗肝纤维化和隐丹参酮肝保护作用机制，从细胞凋亡转导通路及TAK1‐MAPK家族信号转导通路、NF‐κB信号通路等方面进行研究。
　　（1）粉防己碱为传统中药防己的活性生物碱成分，我们采用肿瘤坏死因子‐α(TNF‐α)‐刺激大鼠肝星状细胞T‐HSC/Cl‐6，阐明粉防己碱抗肝纤维化作用机制。永生化大鼠肝星状细胞T‐HSC/Cl‐6给予不同浓度的粉防己碱孵育1小时后，处理未处理TNF‐α(10 ng/ml)并孵育不同时间。同时人正常肝细胞Chang liver给予不同浓度的粉防己碱孵育24小时。粉防己碱(0.39‐50μM)浓度和时间依赖性抑制T‐HSC/Cl‐6细胞生长率，然而浓度小于25μM时粉防己碱未对Chang liver细胞导致细胞毒性。粉防己碱浓度和时间依赖性抑制caspase‐3及其底物PARP裂解，并结合膜联蛋白‐v和碘化丙啶作为荧光探针的流式细胞方法确认25μM粉防己碱诱导T‐HSC/Cl‐6凋亡。同时，粉防己碱浓度和时间依赖性抑制α‐SMA蛋白表达。低浓度粉防己碱（6.25μM）未能诱导细胞凋亡并影响α‐SMA蛋白表达。25μM粉防己碱显著上调JNK和ERK及其上游激酶TAK1磷酸化，并启动NF‐κB P65核转移与IκB‐α降解。另外，TNF‐α轻微抑制T‐HSC/Cl‐6细胞生长率，粉防己碱浓度大于12.5μM时对TNF‐α刺激T‐HSC/Cl‐6呈现细胞毒性。TNF‐α刺激后T‐HSC/Cl‐6的α‐SMA和TRADD蛋白表达时间依赖性增高，而预处理6.25μM粉防己碱能显著下降α‐SMA和TRADD蛋白表达。预处理6.25μM粉防己碱降低JNK和TAK1磷酸化以及NF‐κB p65核转移与IκBα降解。由此可见粉防己碱抗肝纤维化机制至少可能涉及细胞凋亡依赖和非依赖途径，由其浓度决定。高剂量粉防己碱基于活化NF‐κB和磷酸化TAK1/JNK/ERK诱导肝星状细胞凋亡，从而逆转肝纤维化；低剂量粉防己碱抑制TNF‐α刺激肝星状细胞的NF‐κB核转移和TAK1/JNK磷酸化，从而抑制肝星状细胞活化，可能经细胞凋亡非依赖途径。
　　（2）隐丹参酮为丹参的脂溶性活性成分，我们采用D‐氨基半乳糖/内毒素联合诱导的暴发性肝衰竭小鼠模型探讨隐丹参酮的肝保护作用机制。腹腔注射 D‐氨基半乳糖(700 mg/kg)/内毒素(10μg/kg)12小时和1小时前，分别灌胃给予隐丹参酮(20或40 mg/kg)。D‐氨基半乳糖/内毒素联合给药后小鼠死亡率升高，血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性及TNF‐α水平也增高，给予隐丹参酮后上述指标显著降低。隐丹参酮抑制caspase‐3、‐8和‐9活化，显著改善D‐氨基半乳糖/内毒素所致的肝细胞凋亡，并显著降低细胞色素c从线粒体释放到细胞质。隐丹参酮显著抑制 JNK、ERK和 p38磷酸化以及 TAK1磷酸化。此外，隐丹参酮显著抑制 NF‐κB活化并下调促炎症细胞因子的生成。综上所述，隐丹参酮的肝保护分子机制可能与抗凋亡活性有关，并下调MAPK和NF‐κB活性以及至少部分与抑制TAK1磷酸化有关。
　　总而言之，粉防己碱和隐丹参酮有显著的抗肝纤维化和肝保护作用，本研究对开发靶点明确、有效、安全的抗肝纤维化及肝保护药物提供理论基础。

目录

声明

Abbreviations

Introduction

2. Fulminant hepatic failure

3. Liver fibrosis

Chapter 1. Tetrandrine regulates hepatic stellate cells activation via blocking TAK1/JNK and NF‐κB signaling.

Abstract

1.1 Introduction

1.2 Materials and methods

1.3 Results

1.4. Discussion

Chapter 2. Hepatoprotective Effect of Cryptotanshinone in D‐Galactosamine/Lipopolysaccharide‐Induced Fulminant Hepatic Failure

Abstract

2.1 Introduction

2.2 Materials and Method

2.3 Results

2.4 Discussion

Conclusion

参考文献

Publications

致谢