发酵冰糖脐橙皮渣生产菌体蛋白研究

摘要

柑橘皮渣是柑橘加工后的下脚料，长期以来，柑橘皮渣不能有效利用，甚至造成了严重的环境污染，在一定程度上影响了柑橘产业的持续健康发展。利用菌种发酵柑橘皮渣生产菌体蛋白是综合利用柑橘皮渣的一条经济合理之路。
　　 本文以湖南特色水果冰糖脐橙为原料，利用混菌固态发酵冰糖脐橙皮渣生产菌体蛋白。分别进行了优良菌种筛选、菌种诱变选育、固态发酵培养基配方筛选、固态发酵工艺条件优化、发酵产物的小鼠急性经口毒性实验等一系列研究实验，主要研究结果如下：
　　 1、通过富集分离纯化、平板点种、单菌固态发酵、混菌固态发酵、从霉变橙皮、朽木、土壤样本中筛选出了有较强利用冰糖脐橙皮渣能力的野生霉菌2株、野生酵母菌1株。通过三菌混合固态发酵实验，产物真蛋白含量达到8.15％，相比双霉菌发酵提高3.43％，相比单霉菌发酵提高24.61％，与橙皮渣真蛋白含量4.57％相比提高78.34％。通过菌落生长特征、菌株显微特征、生理生化鉴定实验初步鉴定本实验确定采用的混菌发酵野生菌株分别属于米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母。本实验将这三株野生菌株编号为M-6、M-24、Y-3。
　　 2、在温度29℃、发酵时间4d、总接种量0.3ml/g、接种比例1:1:1的条件下，以发酵产物真蛋白含量为指标，对发酵冰糖脐橙皮渣产菌体蛋白的工艺路线进行研究，实验结果表明：使用双霉菌先接入培养，待24h后再接入酵母菌混合培养的二次发酵工艺路线，发酵4d后终产物真蛋白含量比使用双霉菌与酵母同时接种进行发酵的一次发酵工艺路线产真蛋白的含量要高。其发酵产物真蛋白含量分别为8.82％、8.15％，故决定后续试验均采用三菌二次发酵的工艺路线。
　　 3、对野生菌株黑曲霉M-24、米曲霉M-6以纤维素酶活提高为指标，进行紫外、微波和60Co-γ射线三轮诱变，经过诱变其纤维素酶活分别达到213.19U/g、184.47U/g，与野生菌株相比分别提高了2.26倍、2.17倍。诱变所得突变株编号为黑曲霉Co-H104、米曲霉Co-M112。将诱变所得高纤维素酶活突变株黑曲霉Co-H104、米曲霉Co-M112与酿酒酵母Y-3采用二次发酵方式接种于固态发酵培养基，29℃下培养4d，其发酵产物的真蛋白含量达到14.77％，与野生菌株组合发酵产物真蛋白含量8.82％相比提高67.47％。
　　 4、采用统计学方法对固态发酵冰糖脐橙皮渣培养基配方进行优化。通过单因素试验，确定固态发酵培养基最优辅料、氮源、无机盐组合为麸皮、硫酸铵、ZnSO4和CaCl2。且通过实验证明向固态发酵培养基中添加表面活性剂吐温-80、吐温-60对发酵橙皮渣产菌体蛋白没有促进作用。通过最陡爬坡实验，确定响应面试验的中心点为：麸皮15％、硫酸铵3％、无机盐组合0.25％。通过Box-Behnken实验最终确定培养基最优配方为麸皮15％、硫酸铵3.3％、无机盐组合0.27％，在此基础上得到发酵终产物真蛋白含量为19.97％，与预测值相近，与培养基配方优化前相比提高35.20％。
　　 5、采用统计学方法对固态发酵冰糖脐橙皮渣的工艺条件进行优化。通过Plackett-Burman试验，确定培养基料水比、发酵时间、发酵温度为对发酵产物真蛋白含量有显著影响的因素，通过最陡爬坡实验逼近真蛋白产量最大响应区域，确定显著影响因素的最佳响应面实验取值水平。利用Box-Benhnken中心组合设计实验，确定发酵时间4.5d、发酵温度30.5℃、培养基料水比1:3，在该最优发酵条件下，产物真蛋白含量达23.89％，与优化前相比，提高了20.08％。
　　 6、通过菌种筛选、诱变育种、培养基配方筛选与发酵工艺条件优化等一系列实验手段，使发酵冰糖脐橙皮渣产物的真蛋白含量最终达到23.89％，与未发酵的冰糖脐橙皮渣真蛋白含量4.57％相比，提高4.22倍。粗蛋白含量从6.23％提高到28.75％，提高了3.61倍。粗脂肪提高44.23％，粗纤维下降33.33％，粗灰分提高6.08％。由于冰糖脐橙皮渣发酵产物的主要用途是作为菌体蛋白饲料使用，故所选菌株与其发酵产物必须对动物无毒害作用。通过做冰糖脐橙皮渣发酵产物的小鼠急性经口毒性实验，根据GB15193-2003的急性毒性分级标准，属于无毒级。故初步认定冰糖脐橙皮渣发酵产物无毒，可进一步应用于发酵饲料方面。