米糠α--生育酚抗肠炎的功能评价及初步机理研究

摘要

米糠作为我国粮油资源的重大宝库，有效加强其基础研究，尤其是探索其所含生理活性成分的功能及作用的分子机理，将对米糠资源深度开发和利用起到重要推动作用。米糠α-生育酚作为米糠生理活性成分中备受瞩目的一员，具有潜在的预防、治疗和/或控制多种疾病的作用，提供了稻米所含传统营养之外的健康益处。炎症性肠病(IBD)是一种与遗传、肠道感染、免疫失调、环境及精神状态等息息相关的非特异性肠道炎症疾病，对其病因、病机和治疗正处于不断探索中。本文以米糠α-生育酚为研究对象，分别以葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠肠炎模型和脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞RAW264.7体外炎症模型探讨其抗炎功效及初步抗炎机理。 在以1.0％ DSS连续饮用12 d诱导的C57BL/6小鼠肠炎模型中，DSS模型组小鼠精神恍惚，毛发暗淡，体重明显减轻，肉眼血便，严重腹泻;大体观察可见结肠与周围组织粘连，难剥离，肠壁增厚，肠管僵硬，肠黏膜充血、水肿、糜烂，结肠缩短、变重，脾脏肿大;组织病理学评分上升，切片观察显示，炎症累及黏膜及黏膜下层，肠上皮脱落，炎症细胞浸润，杯状细胞减少，腺体及隐窝破坏，并以远端结肠为重;生化指标显示，MPO活性增高，中性粒细胞浸润增多。上述不良症状经米糠α-生育酚干预后明显好转，体重下降、结肠缩短变重得到抑制，脾脏重量、疾病活动指数、组织病理学评分、MPO活性均下降，炎症得到减轻，其中空白对照组、DSS模型组、α-生育酚干预组，DAI评分分别为:0.20±0.42、9.10±0.87、7.40±1.58;MPO活性分别为:0.29±0.05U/g、0.83±0.23U/g、0.67±0.19U/g，表明米糠α-生育酚对DSS诱导的小鼠肠炎具有抑制作用。 在对结肠组织匀浆中SOD活性及MDA含量生化法检测中，DSS模型组结肠匀浆SOD活性下降明显，MDA含量则明显增加;用米糠α-生育酚干预后SOD活性得到提升，MDA含量则减少，表明米糠α-生育酚对DSS引起的小鼠氧化应激具有缓解作用。在对促炎因子IL-6和TNF-α mRNA表达的检测中，DSS模型组两种促炎因子均高表达，而米糠α-生育酚则在mRNA水平有效抑制其表达，此外NO的含量在DSS模型组中较高，干预组中减少。其中空白对照组、DSS模型组、α-生育酚干预组，MDA含量分别为:0.97±0.11nmol/mg protein、3.91±0.36nmol/mg protein、2.73±0.71nmol/mg protein; SOD活性分别为:67.69±3.64U/mg protein、27.23±6.57U/mg protein、40.58±8.38U/mg protein; NO含量分别为:0.75±0.07nmol/mg protein、1.87±0.41nmol/mg protein、1.42±0.43nmol/mg protein; IL-6mRNA相对表达量分别为:1.34±0.14、51.91±31.71、18.91±13.73;TNF-αmRNA相对表达量分别为:1.44±0.24、12.88±4.23、9.33±5.52。这些说明米糠α-生育酚在DSS诱导的小鼠肠炎模型中可能通过抑制小鼠氧化应激而干预相关信号转导途径，减轻炎症介质NO、TNF-α、IL-6的释放。 在对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7体外炎症模型中，采用MTS法确定细胞活性，在不高于120μg/mL浓度下的α-生育酚和1μg/mL LPS对细胞均无明显毒副作用。1μg/mL LPS诱导，30μg/mL、60μg/mL、120μg/mL米糠α-生育酚干预后，ELISA检测RAW264.7细胞IL-6和TNF-α蛋白表达，LPS模型组中两种促炎因子蛋白表达升高明显，在经米糠α-生育酚干预后，两种促炎因子蛋白表达下降，并随着α-生育酚干预浓度的增加，下降更为明显。同时对细胞NO释放量的测定中，LPS刺激明显增加其含量，α-生育酚干预后含量减少，且随α-生育酚干预浓度的增加效果更为明显。这些说明米糠α-生育酚在体外抗炎模型中亦能有效抑制LPS诱导的巨噬细胞炎性介质IL-6、TNF-α、NO的释放。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

1 绪论

1．1 米糠简介

1．2 米糠与α-生育酚

1．3 α-生育酚的生理功能

1．3．1 促进生殖发育

1．3．2 抗氧化

1．3．3 抗肿瘤

1．3．4 心血管效应

1．3．5 其他

1．4 研究思路

2 米糠α-生育酚对DSS诱导小鼠肠炎的抑制作用

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验动物

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．2．4 实验方法

2．2．5 统计学分析

2．3 结果

2．3．1 米糠α-生育酚对DSS诱导小鼠一般情况及疾病活动指数(DAI)的影响

2．3．2 米糠α-生育酚对DSS诱导小鼠结直肠和脾脏的影响

2．3．3 米糠α-生育酚对DSS诱导小鼠结肠病理组织学评分的影响

2．3．4 米糠α-生育酚对DSS诱导小鼠结肠MPO的影响

2．4 讨论

3 米糠α-生育酚抑制DSS诱导小鼠肠炎初步机理

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 实验方法

3．2．4 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 米糠α-生育酚对DSS诱导小鼠肠炎结肠组织MDA水平的影响

3．3．2 米糠α-生育酚对DSS诱导小鼠肠炎结肠组织SOD活性的影响

3．3．3 米糠α-生育酚对DSS诱导小鼠肠炎结肠组织NO水平的影响

3．3．4 结肠组织总RNA完整性分析

3．3．5 米糠α-生育酚对DSS诱导小鼠肠炎结肠组织IL-6 mRNA的影响

3．3．6 米糠α-生育酚对DSS诱导小鼠肠炎结肠组织TNF-α mRNA的影响

3．4 讨论

4 米糠α-生育酚对LPS刺激RAW264．7释放细胞因子的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 细胞株

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验仪器

4．2．4 实验方法

4．2．5 统计学分析

4．3 结果

4．3．1 米糠α-生育酚对LPS诱导RAW264．7细胞毒性结果

4．3．2 米糠α-生育酚对LPS诱导RAW264．7释放NO的影响

4．3．3 米糠α-生育酚对LPS诱导RAW264．7释放TNF-α的影响

4．3．4 米糠α-生育酚对LPS诱导RAW264．7释放IL-6的影响

4．4 讨论

5 结论

6 创新点

参考文献

附录A 攻读硕士学位期间发表的论文

附录B 硕士学位论文资金资助

致谢