油茶种子脂肪酸代谢过程7个关键酶基因的克隆与功能研究

摘要

油茶(Camellia oleifera)是我国重要的木本食用油料树种，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料树种，主要栽培分布于南方丘陵酸性红壤地区。茶油主要由油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸组成，其含量一般在90％以上，是一种优质食用油。在油茶种子脂肪酸代谢的过程中，涉及到一系列调控生理生化代谢过程的酶和基因，其中包括参与饱和脂肪酸合成的装载酶-丙二酰单酰CoA∶ACP转酰酶(MCAT)，参与长链脂肪酸合成的脱水酶-3羟酰CoA脱水酶(HCD)，参与脂肪酸β氧化的脂酰CoA脱氢酶(ACAD)、多功能蛋白(MFP)和脂酰CoA硫酯酶(ACOT)，以及参与植物抗逆的醛脱氢酶(ALDH)和脂氢过氧化物裂解酶(HPL)。本研究是以国审油茶品种‘华硕’发育过程中的种子为材料，在已构建的转录组和表达谱数据库的基础之上，对上述这些关键酶基因进行全长cDNA克隆和生物信息学分析;构建表达载体和干扰载体，让相关基因在不同的宿主细胞进行表达;开展了油茶脂酰CoA脱氢酶基因、醛脱氢酶基因和脂氢过氧化物裂解酶基因等3个基因转录水平的表达研究。主要研究结果如下: 1.油茶脂肪酸代谢过程中7个关键酶基因的克隆与序列分析。根据转录组分析数据，分别设计简并或特异引物，采用RACE技术，克隆到油茶脂肪酸代谢和抗逆的7条基因的全长cDNA序列:(1)CoMCAT基因cDNA全长为1867 bp，GenBank登录号为KJ910337，含有1131 bp的开放读码框，编码376个氨基酸，分子量为39.9797kDa，理论等电点pI为6.84，具有58个氨基酸长度的导肽;含有两个高度保守的基序“GQGXQ”和“GXSXG”，它们分别位于malonyl-CoA结合位点和ACP结合位点上;(2)CoHCD基因cDNA全长为1145 bp，GenBank登录号为KJ910336，含有666 bp的开放读码框，编码221个氨基酸，分子量为25.2045kDa，理论等电点pI为9.40;疏水残基占整个氨基酸残基的48.9％，是亲水性蛋白;具有四个比较明显的跨膜区和蛋白质酪氨酸磷酸酶基序“HGXXGXXRS”;(3) CoACAD基因cDNA全长为2702 bp，GenBank登录号为KJ910338，含有2487 bp的开放读码框，编码828个氨基酸，分子量为92.4113 kDa，理论等电点pI为8.47，具有两个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点“LVHGDFRIDNLVF”，存在五个亚结构域即蛋白激酶域、氨基糖苷磷酸转移酶(APH)结合域、酯酰辅酶A脱氢酶N端域、酯酰辅酶A脱氢酶中心域和酯酰辅酶A脱氢酶C端域;(4) CoMFP基因cDNA全长为2541 bp，GenBank登录号为KJ910342，含有2178 bp的开放读码框，编码725个氨基酸，分子量为79.0333kDa，理论等电点pI为9.11，具有六个比较明显的跨膜区，存有ECH信号序列“VAAIDGLALGGGLEVAMA CHA”、HCDH信号序列“NCTGFAVNRMFFP YTQAAILLVERGV”、ECH基序“-N25-P26-P27”和磷酸结合基序“319G-X-G321-X-X-G324”，且还具有相当保守的盐桥“R500 Nε和E638 Oε”、“R500Nη1/η2和E645Oε1/ε2”及活性位点S428、H449、E461、N499、D523等，存在五个亚结构域即ECH结合域、3HCDH N端结合域、NAD(P)结合Rossmann-fold域、3HCDH_C端结合域和6-磷酸葡糖酸脱氢酶结合域;(5)CoACOT基因cDNA全长为1588 bp，GenBank登录号为KJ910339，含有1164 bp的开放读码框，编码387个氨基酸，分子量为43.5478kDa，理论等电点pI为7.14，存有cNMP结合域1保守序列“VVREGEAGDGVYFIWDG”，C端具有过氧化物酶体信号序列保守的三联肽“SKL”，存在环核苷酸结合域和类似于RmlC-jelly roll fold的结合域;(6) CoALDH基因cDNA全长为1809 bp，GenBank登录号为KJ910340，含有1506 bp的开放读码框，编码501个氨基酸，分子量为54.5137kDa，理论等电点pI为5.50，具有三个比较明显的跨膜区和36个氨基酸长度的细胞质基质转运肽，不仅含有醛脱氢酶基因家族的3个保守结构域即醛脱氢酶谷氨酸激活位点“LELGGKSP”、醛脱氢酶半胱氨酸激活位点“LYNKGEICVAGS”和辅酶结合位点“GFGPTAG”，还具有保守十肽“VSLELGGKSP”及高度保守的“FTGSTE”、“GPWPR”和“IIPMNFP”等序列，存在醛脱氢酶域，是属于依赖于NAD的醛脱氢酶家族;(7) CoHPL基因cDNA全长为1648 bp，GenBank登录号为KJ910341，含有1476 bp的开放读码框，编码491个氨基酸，分子量为54.8581 kDa，理论等电点pI为8.04，具有五个比较明显的跨膜区和由21个疏水氨基酸残基组成且富含脯氨酸的38个aa长度的叶绿体转运肽，含有细胞色素P450蛋白家族的4个保守结构域即结构域A（螺旋Ⅰ区）“LFMLGFNAYGGYSIF”、结构域B（螺旋K区）“LSFDSVKEMELVKSFVYETLRLNPP”、结构域C“RDSKVFDDPEKFIFDRF-TKEK”和结构域D（血红素结合区）“PSESNKQCAAKDYVTLACL”。 2.油茶基因的原核表达。采用pET30a和BL21(DE3)原核表达体系，成功构建了pET30a-MCAT、pET30a-HCD、pET30a-ACAD、pET30a-MFP、pET30a-ACOT、pET30a-ALDH和pET30a-HPL的重组表达质粒，并分别获得了表观分子量约为40kD、25kD、93kD、79kD、44kD、55kD和55kD相应的目的蛋白。 3.油茶基因ACAD、ALDH和HPL在油茶种子不同发育时期的相对表达量。采用实时荧光定量PCR分析了13个不同发育时期油茶种子中CoA CAD、CoALDH和CoHPL相对表达量:(1) CoACAD基因在‘华硕’种子发育过程中有三个转录高峰，分别是在8月初、9月底和10月中旬;(2) CoALDH基因的表达出现了三个转录高峰，分别是在8月上中旬、9月底及10月中旬;(3) CoHPL基因高效地表达主要集中于8月，转录最高峰发生在8月初。 4.油茶基因真核表达载体的构建及CoALDH和CoHPL基因的遗传转化研究。分别构建了CoMCAT、CoHCD、CoACAD、CoMFP、CoACOT、CoALDH和CoHPL的超表达载体和RNA干扰载体，CoALDH和CoHPL基因的真核表达载体农杆菌介导转化哥伦比亚野生型拟南芥，筛选都获得了T0代转基因拟南芥，经抗生素筛选和PCR检测均初步获得了转基因T1代阳性植株。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 绪论

1．1 油茶简介

1．1．1 油茶的生理特性

1．1．2 油茶的生理功能

1．1．3 油茶的研究进展

1．2 植物脂肪酸代谢

1．2．1 脂肪酸的合成

1．2．2 脂肪酸的分解

1．3 种子发育过程中相关基因的研究进展

1．3．1 饱和脂肪酸合成装载酶-丙二酰单酰CoA：ACP转酰酶(MCAT)

1．3．2 脂肪酸代谢系统中的脱水酶-羟脂酰-CoA脱水酶(HCD)

1．3．3 线粒体β氧化中的脱氢酶-脂酰CoA脱氢酶(ACAD)

1．3．4 过氧化物酶体β氧化中的多功能蛋白(MFP)

1．3．5 脂肪酸β氧化中的辅助酶-脂酰CoA硫酯酶(ACOT)

1．3．6 醛脱氢酶(ALDH)

1．3．7 脂氢过氧化物裂解酶(HPL)

1．4 本研究的意义、主要内容和技术路线

1．4．1 本研究目的意义

1．4．2 本研究的主要内容

1．4．3 本研究的技术路线

第二章 油茶种子脂肪酸代谢过程7个关键酶基因的克隆与序列分析

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 实验研究方法

2．2 结果与分析

2．2．1 油茶种子提取的总RNA质量

2．2．2 油茶MCAT基因克隆及生物信息学分析

2．2．3 油茶HCD基因克隆及生物信息学分析

2．2．4 油茶ACAD基因克隆及生物信息学分析

2．2．5 油茶MFP基因克隆及生物信息学分析

2．2．6 油茶ACOT基因克隆及生物信息学分析

2．2．7 油茶ALDH基因克隆及生物信息学分析

2．2．8 油茶HPL基因克隆及生物信息学分析

2．3 讨论

第三章 油茶种子脂肪酸代谢过程7个关键酶基因的原核表达

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 实验研究方法

3．2 结果与分析

3．2．1 表达载体的质粒提取

3．2．2 油茶MCAT基因的原核表达

3．2．3 油茶HCD基因的原核表达

3．2．4 油茶ACAD基因的原核表达

3．2．5 油茶MFP基因的原核表达

3．2．6 油茶ACOT基因的原核表达

3．2．7 油茶ALDH基因的原核表达

3．2．8 油茶HPL基因的原核表达

3．3 讨论

第四章 油茶ACAD、ALDH和HPL基因的时空表达

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 实验研究方法

4．2 结果与分析

4．2．1 油茶不同发育时期种子RNA的提取

4．2．2 内参基因及靶基因的克隆

4．2．3 qPCR分析油茶ACAD、ALDH和HPL三个基因的表达研究

4．3 讨论

第五章 油茶种子脂肪酸代谢过程7个基因的真核载体构建及CoALDH、CoHPL基因的转拟南芥的初步研究

5．1 材料

5．1．1 载体与菌株

5．1．2 试剂

5．1．3 主要仪器设备

5．2 实验方法

5．2．1 构建真核表达载体

5．2．2．构建RNA干扰载体

5．3 结果与分析

5．3．1 真核表达载体的质粒提取

5．3．2 真核载体的构建

5．3．3 油茶ALDH和HPL基因转拟南芥植株的筛选

5．4 讨论

第六章 总结

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 研究展望

参考文献

附录A 部分药品配制方法

附录B 使用仪器制造单位

附录C：硕士期间的主要学术成果

致谢