绿色巴夫藻多不饱和脂肪酸合成关键酶基因的克隆表达及功能研究

摘要

多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)是指含有两个或两个以上双键且碳链长为16-22个碳原子的直链脂肪酸，包括二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳六烯酸(DHA)等，其中EPA/DHA.具有重要的生理作用如：营养强化，调控脂类代谢，预防和治疗动脉粥样硬化和心血管疾病，调节机体的免疫功能，调节视力和大脑发育，调节中枢神经系统功能，还可以开发为抗肿瘤药物。目前，深海鱼油是EPA及DHA等PUFA的重要商业来源，然而仅仅依靠原有的鱼油资源已经无法满足日益扩大的市场需求。另外，研究发现，鱼类并不是PUFA的真正生产者，而是通过吞食富含PUFA的海洋微藻后在体内积累。海洋微藻是EPA/DHA的初级生产者，而且从微藻中提取PUFA比生产鱼油工艺简单，产品没有鱼腥味，胆固醇含量低。因此，利用海洋微藻生产PUFA成为获取EPA和DHA的一种新的手段。但是海洋微藻多为自养藻，生长缓慢，细胞得率低，培养过程中易染杂菌，另外对微藻的规模化培养及细胞改良等方面的研究尚处于实验室阶段，所以利用微藻大规模提取生产EPA/DHA来满足社会需求还不现实。 PUFA的生物合成始于C18-PUFA：LA和ALA，通过一系列的脂肪酸脱氢酶(fatty acid desaturase，FAD)的脱氢作用和脂肪酸碳链延伸酶(fatty aicdelongase，FAE)的碳链延伸作用逐步完成。FAD催化的脱氢反应是将脂肪酸链中的C-C转化为C=C，每个FAD都在酰基链的特定位置引入双键；FAE是参与C18、C22-PUFA的碳链延伸反应的一类延伸酶复合体，它催化供体(乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A)的两个碳原子引入PUFA碳链中增加其碳链长度。 随着对PUFA生物合成途径及调控机制研究的深入，从分子水平上研究微藻PUFA合成的影响因素，通过对PUFA合成途径关键酶基因的克隆，实现基因的异体高效表达，以期得到大量的PUFA，为解决EPA/DHA资源，降低生产成本，提供一条新途径。而且FAD和FAE在植物基因工程，食品工程和发酵工程等领域的广阔应用前景是毋庸置疑的，在上述领域的应用也将进一步促进对脂肪酸合成途径的认识和研究。本论文实验材料绿色巴夫藻(Pavlova viridis)为自养微藻，EPA和DHA含量丰富，分别占总脂含量的16％和9％，是研究脂肪酸合成途径中相关脱氢酶和延伸酶很好的实验材料。本文的工作和研究成果如下： 1.研究了培养温度、光照强度对P.viridis生长及其EPA/DHA含量的影响，优化培养条件。结果表明，P.viridis的生长温度范围较广，在16℃～25℃均可生长，但是低温(18℃)有利于藻体内EPA和DHA的积累，经气相色谱分析此条件下的EPA和DHA含量分别为16.25％，9.226％，较25℃条件下提高了12.45％和8.226％。由此证实：尽管较高的温度有利于P.viridis的生长，但此时不饱和脂肪酸含量较低。P. viridis为自养生物，当光照强度较弱时，该藻生长停滞，此时的EPA和DHA含量较低；随着光照强度的增加，藻体生长加快，同时EPA和DHA的含量也增加到16.62％和6.79％。通过GC/MS测定18℃光照培养条件下P.viridis的脂肪酸组成，发现P.viridis不饱和脂肪酸种类齐全，含有多种不饱和脂肪酸，是克隆脱氢酶基因和延伸酶基因很好的实验材料。 2.总RNA的质量直接影响到所建文库的优劣，本文在对比了Trizol试剂法，异硫氰酸胍一步法，CTAB法等方法的基础上，摸索出一种适用于只P.viridis总RNA提取的有效方法-CTAB和酸酚相结合的改良CTAB法。此方法可有效去除RNA提取过程中多糖和多酚类物质的干扰，所得RNA质量较高。利用改良的CTAB法提取P. viridis总RNA，构建其cDNA文库，所建cDNA文库滴度为6×106pfu/mL，重组率达到98％，插入片段在250 bp-2.0 kbp之间，表明该文库达到建库要求。通过表达序列标签(expressed sequence tags，ESTs)技术对P. viridis cDNA文库进行随机序列扩增和测序，将所得200条EST序列与GenBank中已报道基因进行BLAST同源性比对，获得了许多功能基因的遗传信息，为克隆基因全长和进一步开发微藻的新功能基因奠定了基础。经过比对发现，在这200条ESTs序列中参与蛋白质合成的基因和参与能量代谢(包括光合作用和呼吸作用)的基因含量比较高，分别占41％和20％。但是通过EST技术，没有筛选到脱氢酶基因或者延伸酶基因序列，说明ESTs方法不适用于丰度较低基因的筛选。 3.利用SMART RACE技术首次克隆了P.viridis C20-延伸酶基因(elkj)。 利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作为elkj表达的报告基因，将克隆的C20-延伸酶基因(elkj)和GFP基因融合，实现了elkj在Escherichia coli中的表达，证实elkj编码的蛋白为膜整合蛋白，并且具有C20-延伸酶活性。 elkj基因全长945 bp，编码314个氨基酸，推测蛋白质大小为34.5 kDa，经TMHMM疏水性预测分析，ELKJ蛋白七次穿膜，C末端位于胞内且具有双赖氨酸结构的内质网滞留信号。经Southern blot分析，elkj基因在P.viridis基因组中为单拷贝。 C20-延伸酶催化EPA合成DPA，是从EPA到DHA合成的关键步骤。经过气相色谱分析大肠杆菌脂肪酸甲酯组成，显示重组菌E. coli DE3/pwalEL具有催化EPA产生DPA的C20-延伸酶酶活，确认了在P.viridis中从EPA到DHA的转化需要两步合成(two step conversion)。 实验过程中发现，当elkj基因在大肠杆菌中表达时，重组菌E. coliDE3/pwalEL生长较对照菌株主E. coli DE3/pWaldo-gfpe弱，表明ELKJ的表达对宿主细胞产生了毒性效应，导致表达困难，无法得到目的蛋白产物。因此，将ELKJ蛋白和GFP蛋白融合表达，通过观察GFP的荧光，反映ELKJ的表达情况。结果显示，在激光共聚焦显微镜下观察到重组菌E. coli DE3/pwalEL发出绿色荧光，说明ELKJ-GFP融合蛋白正确表达，ELKJ蛋白部分插入细胞膜中，融合蛋白未形成包涵体；通过测定全细胞荧光信号，对比不同条件下ELKJ的表达量，确定ELKJ了蛋白的最优表达条件。上述实验结果说明，利用GFP的自发荧光可以作为检测膜蛋白各种表达条件的指标，为膜蛋白的研究提供了一个有效的方法，为真核生物膜蛋白的研究奠定基础。 4.首次克隆了P.viridis的△4、△5脱氢酶全长基因序列，包括外显子，内含子以及基因的启动子序列。海洋微藻的分子生物学起步较晚，可供参考的遗传信息和操作工具很少，在克隆P.viridis脱氢酶基因时进行了广泛探索，对构建P. viridis cDNA文库进行大量筛选后，没有得到脱氢酶基因序列，改用SMARTRACE技术以及SEFA PCR技术成功扩增了△4-脱氢酶基因(phjDes4)和Δ5-脱氢酶基因(pkjDes5)。pkjDes4其开放阅读框全长1440 bp，编码479个氨基酸，提交GenBank获得accession no.EF486526；pkjDes5其开放阅读框全长1278 bp，编码425个氨基酸，提交GenBank获得accession no.EF486527。经过Southern blot分析，pkjDes4和pkjDes5同C20-elongase基因一样，在P.viridis基因组中均为单拷贝基因，证实PUFA合成途径中的相关酶基因在基因组中的拷贝数均较低，利用大量筛选文库得到目的基因的方法比较困难。 5.利用从P.viridis中克隆的C20-elongase基因elkj和Δ4-desaturase基因pkjDes4，完成了elkj在Pachia pastoris中的表达及功能验证，并构建了elkj和pkjDes4在P.pastoris中的共表达载体，为利用现代生物技术生产DHA奠定基础。利用pPIC3.5K整合型载体，构建elkj在P.pastoris中的表达载体pPEL，筛选到高拷贝整合宿主重组菌株G3，经气相色谱分析P. pastoris GS115/pPEL脂肪酸甲酯成分，显示重组菌G3具有催化EPA产生DPA的C20-elongase酶活，完成了elkj在P.pastoris中的功能验证，为利用P.pastoris构建DHA的体外合成途径奠定基础。 6.以乳酸乳球菌表达载体pNZS148为骨架在C末端融合GFP，首次构建了一个乳酸乳球菌表达载体pKj-gfp，并利用该载体，实现了ELKJ在Lactococcus lactis中的过量表达。由于NICE系统(NIsin controlled expressionsystem)的严谨性及L.lactis作为宿主表达膜蛋白的优越性，NICE系统被发展为可控制的膜蛋白质表达的理想系统。通过激光共聚焦显微镜观察nisin(乳链菌肽)诱导后L.lactis NZ9000/pKj-el绿色荧光，未发现不发荧光细胞，说明质粒在L.lactis中稳定性。利用GFP荧光检测ELKJ的表达过程，大大简化了膜蛋白表达菌株筛选和纯化的过程。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章绪论

1.多不饱和脂肪酸简介

1.1 PUFA的概念和分类

1.2 PUFA的功能

2.多不饱和脂肪酸的生物资源

2.1 EPA和DHA的传统商业来源

2.2 EPA和DHA的其他来源

3.多不饱和脂肪酸的生物合成途径

4.脂肪酸脱氢酶

4.1脂肪酸脱氢酶的种类和分布

4.2.脂肪酸脱氢酶的结构特点

4.3脂肪酸脱氢酶的活性中心及催化机理

4.4脂肪酸脱氢酶分子生物学的研究进展

4.5海洋微藻脂肪酸脱氢酶分子生物学的研究进展

5.脂肪酸碳链延伸酶

5.1脂肪酸碳链延伸酶简介

5.2脂肪酸碳链延伸反应机理

5.3脂肪酸碳链延伸酶的结构特点

5.4脂肪酸链延伸酶的分子生物学研究进展

6.论文的研究意义和研究内容

第二章环境因子对绿色巴夫藻生长以及不饱和脂肪酸含量的影响

2.1材料与方法

2.1.1藻种及培养

2.1.2培养基

2.1.3试剂

2.1.4主要仪器及型号

2.1.5透射电镜观察P.viridis细胞超微结构

2.1.6环境因子对P.viridis生长的影响

2.1.7细胞浓度测定

2.1.8环境因子对P.viridis EPA及DHA含量的影响

2.1.9环境因子对C20-elongase基因转录水平的影响

2.2结果

2.2.1透射电镜观察P.viridis细胞超微结构

2.2.2环境因子对P.viridis生长的影响

2.2.3环境因子对P.viridis EPA和DHA的影响

2.2.4环境因子对C20-elongase基因(elkj)转录水平的影响

3.小结与讨论

第三章绿色巴夫藻总RNA提取方法的改进及其表达文库的构建与EST分析

3.1材料和方法

3.1.1菌株及载体

3.1.2主要试剂

3.1.3培养基

3.1.4仪器及型号

3.1.5 P.viridis总RNA提取

3.1.6总RNA质量的检测

3.1.7 P.viridis cDNA文库构建及检测

3.1.8表达序列标签分析P.viridis cDNA文库

3.2结果与分析

3.2.1 P.viridis RNA提取方法的比较

3.2.2三种方法提取的P.viridis总RNA质量检测

3.2.3 P.viridis cDNA文库的构建及质量检测

3.2.4表达序列标签筛选P.viridis功能基因

3.3讨论

第四章绿色巴夫藻C20-elongase基因的克隆及原核表达

4.1材料方法

4.1.1菌种和载体

4.1.2试剂

4.1.3主要仪器

4.1.4全长基因克隆

4.1.5 CTAB法提取P.viridis的DNA

4.1.6 Southern杂交

4.1.7 ELKJ-GFP融合蛋白的原核表达

4.1.8膜蛋白表达对E.coli DE3的毒性测定

4.2结果

4.2.1 C20-elongase全长基因克隆

4.2.2 C20-elongase基因elkj序列分析

4.2.3 ELKJ-GFP融合蛋白在大肠杆菌中的表达

4.3讨论

第五章绿色巴夫藻脱氢酶基因的克隆及相关序列分析

5.1材料方法

5.1.1试剂

5.1.2 △4-desaturase全长基因克隆

5.1.3 △5-desaturase全长基因克隆

5.1.4 PCR产物亚克隆及测序

5.2结果

5.2.1P.viridis △4-desaturase全基因克隆

5.2.2pkjDes4序列分析

5.2.3P.viridis △5-desaturase全基因克隆

5.2.4 pkjDes5序列分析

5.3讨论

第六章DHA合成途径的体外构建

6.1材料方法

6.1.1菌种

6.1.2培养基和试剂

6.1.3P.pastoris表达

6.1.4 elkj基因在P.pastoris中的表达

6.1.4 C20-elongase和△4-desaturase的共表达

6.2结果

6.2.1 ELKJ在P.pastoris中的表达

6.2.1 ELKJ和pKjDes4在P.pastoris中的共表达

6.3讨论

第七章乳酸菌膜蛋白-FP融合蛋白表达载体构建

7.1材料方法

7.1.1菌株和质粒

7.1.2培养基

7.1.3试剂

7.1.4乳酸乳球菌感受态细胞的制备

7.1.5乳酸乳球菌电转化法

7.1.6 pKj-gfp融合载体的构建

7.1.7 pKj-el融合载体构建

7.1.8L.lactis NZ9000/pKj-el的诱导表达

7.1.9利用荧光监测ELKJ-GFP融合蛋白的表达

7.2结果

7.2.1 pKj-grp融合载体的构建

7.2.2利用荧光监测膜蛋白的表达过程

7.3讨论

参考文献

攻读博士学位论文期间发表论文

外文写作一

外文写作二

致谢