不同温度、碳源和氮源对六种海洋微藻中多不饱和脂肪酸的影响及绿色巴夫藻16SrRNA基因的克隆与序列分析

摘要

[目的]
　　 本课题期望通过分析观察不同培养温度、碳源和氮源对绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)，湛江等鞭金藻(Dicrateria inornata)，微绿球藻(Nannochloropsis culata)，小球藻(Chlorella vulgaris)，小环藻(Cyclotella caspia)，海链藻(Thalassiosira)等六种富含二十二碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的海洋微藻中多不饱和脂肪酸组成的影响，筛选出有利于这六种海洋微藻中EPA、DHA生物合成的优化培养条件。此外，通过对绿色巴夫藻的16S rRNA基因的克隆和测序，并与巴夫藻属其它藻种的16S rRNA基因进行同源性比对，构建遗传进化树，从而分析巴夫藻属的系统发育关系。
　　 [方法]
　　 1.六种海洋微藻的培养
　　 温度实验：培养液采用湛水107-18号配方(见表1)，藻种按1:10接种量至300mL的锥形瓶中，14:10(光照/黑暗)恒定光照培养，设置10℃，15℃，20℃，25℃四种不同培养温度来分别培养本实验选用的六种藻种。
　　 碳源实验：去掉湛水107-18号配方中的碳源，分别加入本实验考察的葡萄糖，半乳糖，蔗糖作为碳源，温度采用上述实验中所得到的各种藻类的最佳培养温度，其它操作同温度实验。
　　 氮源实验：去掉湛水107-18号配方中的氮源，分别加入本实验考察的胰蛋白栋，酵母膏，氯化铵作为氮源，温度采用上述实验中所得到的各种藻类的最佳培养温度，其它操作同温度实验。
　　 2.基于GenBank中已知微藻的16S rRNA基因序列设计引物，利用RT-PCR的方法从六种海洋微藻中克隆16S rRNA基因的片段序列。
　　 3.基于绿色巴夫藻的16S rRNA基因及提交到GenBank中的巴夫藻属其他藻种的16S rRNA基因构建进化树。
　　 [结果]
　　 1.温度实验：在10℃，15℃，20℃，25℃四种不同温度下，本实验选取的六种藻种均能较好的生长。在10～20℃之间，绿色巴夫藻的EPA含量随着温度的升高而增加，在20℃时EPA含量达到最大值，占总脂的25.93％；DHA含量随温度变化不大。在10～25℃整个实验温度观察范围，湛江等鞭金藻的DHA含量随着温度的增加而逐渐减少，在10℃条件下有最大值，占总脂含量的17.11％；EPA含量随温度变化不大。
　　 2.碳源实验：在以葡萄糖，D(+)半乳糖，蔗糖作为碳源，最佳培养温度的条件下，绿色巴夫藻和湛江等鞭金藻均能较好的生长。绿色巴夫藻在以葡萄糖为碳源的条件下培养，C18:3(ω-3)含量达到占总脂的56.11％的最大值，而EPA含量变化不大。湛江等鞭金藻在以葡萄糖作为碳源的条件下培养，DHA含量达到占总脂的14.01％的最大值；同时，在三种不同碳源的条件下培养，其EPA含量变化不大。
　　 3.氮源实验：在最佳培养温度条件下，分别以胰蛋白栋，酵母膏，氯化铵作为氮源，绿色巴夫藻和湛江等鞭金藻均能较好的生长。绿色巴夫藻在以酵母膏为氮源的条件下培养时，其C18:3(ω-3)含量达到占总脂的51.14％的最大值，而EPA含量变化不大。湛江等鞭金藻在以胰蛋白栋作为氮源的条件下培养时，其DHA含量达到占总脂的15.9％的最大值，而分别在三种不氮源的条件下培养，其EPA含量变化不大。
　　 4.克隆得到了绿色巴夫藻的16S rRNA基因部分序列，与巴夫藻属其他藻种的16S rRNA基因具有较高的同源性。基于16S rRNA基因的巴夫藻属构建的进化树显示绿色巴夫藻与其他的巴夫藻属藻种的遗传距离在0.008～0.048之间。
　　 [结论]
　　 1.在培养液采用湛水107-18号配方，温度为20℃的培养条件下，绿色巴夫藻的EPA达到最大值，占总脂的25.93％。同时湛江等鞭金藻的DHA的含量在温度10℃的培养条件下达到最大值，占总脂的17.11％。
　　 2.在以葡萄糖作为碳源的培养条件下，绿色巴夫藻的C18:3(ω-3)含量达到最大值，占总脂的56.11％。在以葡萄糖作为碳源的培养条件下，湛江等鞭金藻DHA含量达到最大值，占总脂的14.01％。
　　 3.在以酵母膏作为氮源的培养条件下，绿色巴夫藻的C18:3(ω-3)含量达到最大值，占总脂的51.14％。在以胰蛋白栋作为氮源的培养条件下，湛江等鞭金藻DHA含量达到最大值，占总脂的15.9％。
　　 4.克隆测序得到了绿色巴夫藻的16S rRNA基因部分序列与巴夫藻属其他藻种的16S rRNA基因具有较高的同源性，遗传距离在0.008～0.048之间。