大米中污染物镉的体外消化与吸收研究

摘要

我国是大米生产和消费大国，60％以上的人口以大米为主食，随着我国耕地和水体污染的加剧，我国大米镉污染形势严峻。镉(Cd)为已知最易在体内蓄积的有毒物质之一，且低剂量镉暴露会引发癌症和许多慢性疾病的发生，若长期摄入镉污染大米势必对健康造成潜在危害。因此，研究大米中污染物Cd的消化与吸收，对大米中镉暴露风险评估和进行有效膳食干预具有重要现实意义。
　　本文结合RIVM体外胃肠消化，利用建立的Caco-2/HT-29(70∶30)细胞快速共培养肠吸收模型，研究了大米中Cd的体外消化生物可给性与肠吸收的生物有效性，分析了大米中金属元素本身的Ca、Fe、Cu、Zn与Cd的消化、吸收变化关系，研究了表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对Cd及其它金属元素吸收的影响，最后对大米中Cd进行了风险评估。主要研究结果如下:
　　确定添加丁酸分化剂快速建立Caco-2/HT-29(70∶30)细胞共培养肠吸收模型。对Caco-2/HT-29细胞共培养肠吸收模型中两种细胞的接种比例(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50)和快速培养分化剂的种类（丁酸、抗坏血酸）进行筛选，通过测定模型的跨膜电阻值值、两侧碱性磷酸酶活性之比(AP/BL)、荧光黄通透系数及形态学观察等评价指标，结果表明Caco-2/HT-29按照70∶30比例接种，添加丁酸分化剂建立的快速共培养肠吸收模型在紧密连接性、通透性、极性以及形态方面符合标准培养要求。
　　相同进食量的三种米饭在胃阶段Cd的生物可给性大于肠阶段。经胃阶段消化的后生物可给性范围为59.04％～80.23％，平均值为69.79％;小肠阶段消化中生物可给性范围为37.14％～52.93％，平均值为42.58％。胃消化2h后:米饭C80.23％＞米饭A70.11％＞米饭B59.04％，肠消化7h后:大米A（低镉水平:，0.111 mg/kg）、大米B（中镉水平，0.485 mg/kg））和大米C（高镉水平，0.724 mg/kg）中Cd的生物可给性分别为:52.63％、48.19％、39.68％。
　　不同进食量的同种大米在胃阶段Cd的生物可给性大于肠阶段，在肠消化阶段随着进食量的增大而递减。胃消化2h后Cd的生物可给性:20g米饭B88.19％＞30 g米饭B80.84％＞10 g米饭B59.04％;10g米饭C88.23％＞20g米饭C77.29％＞30 g米饭C62.08％。肠消化7h时Cd的生物可给性:10g米饭B48.43％＞20 g米饭B32.15％＞30 g米饭B21.74％;10 g米饭C39.68％＞20g米饭C25.03％＞30 g米饭C19.63％。
　　消化液中的元素存在相互影响作用。从胃2h到肠0.5 h时Cd的生物可给性逐渐下降，消化上清液中Ca、Fe、Cu的质量浓度逐渐升高，Zn的质量浓度与Cd的生物可给性同时呈下降趋势。在肠消化整个阶段中:消化上清液中Ca和Fe的质量浓度变化相似，但Fe的变化幅度较大;Cu更容易溶解在消化液中，Zn的质量浓度与Cd的生物可给性变化趋势一致。
　　Ca、Fe、Cu、Zn、Cd在细胞模型吸收实验中转运吸收率差异较大，两种浓度的EGCG添加到消化液中对Cd的吸收存在一定程度的抑制作用。10 g米饭C消化液、添加21.85μmol/L EGCG和添加43.70μmol/L EGCG3组实验数据显示Cd的转运吸收率依次逐渐降低，3组实验Cd的转运吸收率分别为37.04％、31.48％、和23.15％，Fe和Cu的转运吸收率依次逐渐升高，Fe和Cd、Cu和Cd的转运吸收率变化规律一致。
　　蒸煮过程对大米C（高Cd水平）中Cd的生物有效性影响不大。分别以米和米饭计算，在整个胃肠消化吸收阶段中Cd的生物有效性差异较小，分别为29.13％和29.74％。同一组中，大米C与米饭C的的生物有效性差异在0.61％～0.74％之间，添加21.85μmol/L EGCG时，生物有效性分别降低了0.93％、2.33％;添加43.70μmol/LEGCG时，分别降低了0.88％、1.27％。
　　初步风险暴露评估得出:大米C、大米B、大米A中Cd的每日最大暴露量分别为2.544μg、1.711μg、0.374μg，其中大米C和大米B中分别是规定每日可耐受暴露量的3.08倍和2.06倍。大米C、大米B、大米A中Cd的每日最大吸收量分别为101.337μg、82.443μg、20.801μg。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 体外消化模型概述

1．2 常用体外消化模型

1．2．1 PBET法

1．2．2 IVG法

1．2．3 DIN法

1．2．4 SHIME法

1．2．5 RIVM法

1．2．6 其他新方法

1．3 Caco-2／HT-29细胞共培养肠吸收单层模型

1．3．3 Caco-2／HT-29共培养肠细胞模型应用研究进展

1．4 大米中镉污染

1．4．1 国内外大米镉限量标准

1．4．2 稻米中镉的存在形态

1．4．3 镉的吸收及代谢途径

1．4．4 膳食中镉的生物可给性和生物有效性

1．5 大米中污染物镉的去除与控制技术

1．5．1 种植与加工过程中控制

1．5．2 利用多酚类物质控制

1．6 本文的研究内容和意义

1．6．1 研究意义

1．6．2 研究内容

2 Caco-2／HT-29细胞共培养的肠吸收模型建立

2．1 前言

2．2 材料与试剂

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂

2．3 实验仪器

2．4 实验方法

2．4．1 主要试剂的配制

2．4．2 细胞培养

2．4．3 细胞肠吸收模型的建立

2．4．4 跨膜电阻值测定

2．4．5 碱性磷酸酶活性测定

2．4．6 表观通透系数的测定

2．4．7 细胞存活率的MTT法测定

2．4．8 细胞单层模型的形态学观察

2．5 结果与分析

2．5．1 不同比例Caco-2／HT-29细胞模型的电阻值测定结果与分析

2．5．2 不同比例Caco-2／HT-29细胞模型的AKP活性测定结果与分析

2．5．4 不同比例Caco-2／HT-29细胞模型的形态学观察结果与分析

2．5．5 MTT法筛选快速培养促分化剂的结果与分析

2．5．6 快速培养Caco-2／HT-29(70：30)细胞模型的电阻值测定结果与分析

2．5．7 快速培养Caco-2／HT-29(70：30)细胞模型的AKP活性测定结果与分析

2．5．8 快速培养Caco-2／HT-29(70：30)细胞模型的通透性测定结果与分析

2．5．9 快速培养Caco-2／HT-29(70：30)细胞模型的形态学观察结果与分析

2．6 本章小结

3 大米中污染物镉的体外消化研究

3．1 前言

3．2 材料与试剂

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂

3．3 实验仪器

3．4 实验方法

3．4．1 器具清洗

3．4．2 大米样品的制备

3．4．3 米饭样品的制备

3．4．4 体外胃肠消化模拟

3．4．5 样品中镉及其他主要元素的ICP-MS法测定

3．4．6 大米样品中镉的体外消化生物可给性计算

3．4．7 数据处理与分析

3．5 结果与讨论

3．5．1 三种大米中镉及其他金属元素含量测定结果与分析

3．5．2 三种大米蒸煮前后镉及钙、铁、铜、锌含量变化结果与分析

3．5．3 相同进食量的三种米饭中镉体外消化生物可给性研究结果与分析

3．5．4 不同进食量的同种米饭中镉体外消化生物可给性研究结果与分析

3．5．5 镉超标米饭中镉生物可给性与钙、铁、铜、锌含量变化结果与分析

3．6 本章小结

4 大米中污染物镉的体外肠吸收研究与初步风险评估

4．1 前言

4．2 材料与试剂

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验试剂

4．3 实验仪器

4．4 实验方法

4．4．2 镉超标米饭的体外消化实验

4．4．3 镉超标米饭的体外肠吸收实验

4．4．4 EGCG对米饭消化液中镉吸收的影响研究

4．4．7 样品中镉的体外吸收生物有效性计算

4．4．8 大米中污染物镉的每日暴露量计算

4．4．9 大米中污染物镉的每日最大吸收量计算

4．4．10 数据处理与分析

4．5 结果与讨论

4．5．1 镉超标大米、米饭及其消化液中元素含量测定结果与分析

4．5．2 EGCG对镉超标大米米饭消化液中镉转运吸收率影响结果与分析

4．5．3 EGCG对镉超标米饭消化液中镉生物有效性影响结果与分析

4．5．4 大米中污染物镉的每日暴露量评估结果与分析

4．5．5 大米中污染物镉的每日最大吸收量评估结果与分析

4．6 本章小结

5 总结与展望

5．1 总结

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

附录

致谢