SECM实时分析金黄色葡萄球菌菌膜中过氧化氢酶方法研究

摘要

电化学扫描显微镜(SECM)是一种具有高时空分辨度的新型扫描探针显微镜，它是由美国的电化学家Bard与1989年提出的。电化学扫描显微镜因为其“化学灵敏性”，它不仅可以表征检测样本的表面形貌，更重要的是他可以分辨其电化学活性。电化学扫描显微镜弥补了其他扫描技术（比如扫描隧道显微镜以及原子力显微镜）的诸多不足，对于被固定在检测基底并自身带有电荷或能产生电活性物质的生物细胞，它能直接得到检测样本的电化学活性信息。
　　电化学扫描显微镜具有良好的选择性以及极高的检测灵敏度，同时也可实现生物体系的无损伤实时在线监测分析，在生物体系形貌和微区化学信息分析等方面都有着独特的研究应用优势。本次实验研究将选择食品工业中出现的典型细菌菌膜（金黄色葡萄球菌菌膜），探讨单一细菌菌膜形成中细菌自身产生的具有氧化还原活性的生物酶在菌膜形成与生长过程中的变化，并将其与菌膜的实时变化相对照，以探索菌膜形成过程中的氧化还原活动的变化，以寻求可有效的运用于食品工业中控制菌膜污染的方法途径。
　　本文首先使用结晶紫染色法这一传统菌膜检测方法对菌膜在盖玻片上的生长过程进行了初步检测，通过对菌膜生长后12、24、36、48、60、72 h的OD值进行对比，发现菌膜的生长是一个先上升，当到达峰值后开始下降，并慢慢趋于平缓的过程，菌膜在生长36 h左右时，菌膜在盖玻片上的粘附量达到最大，OD值约为0.33。这一检测过程所反映的菌膜生长趋势也与其他实验研究方法的结果相一致，这保证了本实验的正确性也为后续的SECM实验提供了依据。
　　其次使用SECM做逼近曲线、循环伏安曲线、以及X轴扫描曲线等对SECM仪器与检测探针进行了调试与校准。用方波伏安曲线确定了HQ的最佳检测浓度，在HQ浓度为4 mmol/L时，SECM既可以保持良好的电信号强度，同时避免了检测试剂浓度过高所引起的SECM仪器与待检测菌膜损伤。这些实验为后续的菌膜形貌扫描、菌膜中过氧化氢酶的实时变化检测提供了研究基础。
　　本文其后通过过氧化氢酶的模拟实验，验证了使用HQ与H2O2检测固定菌膜中过氧化氢酶这一方法的可行性。使用SECM进行了金黄色葡萄球菌菌膜的初步形貌扫描，通过调整扫描速度，提供了不同清晰度的菌膜形貌图像，并进行了初步的SECM图像分析。对金黄色葡萄球菌菌膜中过氧化氢酶进行实时监测，并将不同培养时间段的菌膜所得到的检测峰电流进行作图分析，总结了金黄色葡萄球菌菌膜整个形成过程中其过氧化氢酶量的变化:过氧化氢酶的量随着菌膜形成量的上升而上升，随着菌膜的自溶分解现象的产生而下降。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 扫描电化学显微镜优势与特点

1．3 SECM实验装置

1．4 超微电极的特点

1．5 SECM的基本原理

1．6 SECM的工作模式

1．6．1 反馈模式

1．6．2 产生／收集模式

1．7 金黄色葡萄球菌生物学特性

1．8 金黄色葡萄球菌的危害

1．9 金黄色葡萄球菌菌膜的研究进展

1．9．1 金黄色葡萄球菌菌膜的形成过程

1．9．2 菌膜检测的常见方法

1．10 金黄色葡萄球菌菌膜与食品安全

1．11 生物被膜的控制

1．12 细菌通过提升自身的抗氧化代谢途径来提升自身耐药性

1．13 本文立题背景和意义，以及主要研究内容

2 菌膜形成量检测与SECM检测条件优化

2．1 引言

2．2 实验仪器设备与试剂

2．2．1 实验设备仪器

2．2．2 实验试剂

2．3 实验方法

2．3．1 试剂配制

2．3．2 菌种的活化与母液的制备

2．3．3 菌膜的培养

2．3．4 结晶紫染色法检测菌膜的生长情况

2．3．5 SECM的调试与最佳检测条件的筛选

2．4 结果与讨论

2．4．1 结晶紫染色法检测菌膜生长情况

2．4．2 SECM调试与最佳检测条件筛选

2．4．3 HQ与H2O2检测原理与分析

2．5 本章小结

3 菌膜SECM图像与过氧化物酶实时检测

3．1 引言

3．2 实验设备仪器与试剂

3．2．1 实验设备仪器

3．2．2 实验试剂

3．3 实验方法

3．3．1 试剂配制

3．3．2 菌种的活化与母液的制备

3．3．3 菌膜的培养

3．3．4 菌膜中过氧化氢酶的模拟实验

3．3．5 金黄色葡萄球菌菌膜的形貌扫描

3．3．6 金黄色葡萄球菌菌膜中过氧化氢酶的实时监测

3．4 结果与讨论

3．4．1 过氧化氢酶的模拟实验

3．4．2 金黄色葡萄球菌菌膜的形貌扫描

3．4．3 金黄色葡萄球菌菌膜中过氧化氢酶的实时监测

3．5 本章小结

4 结论与展望

4．1 主要结论

4．2 展望

参考文献

附录

致谢